透析用水细菌及内毒素含量在热消毒和化学消毒全过程中的动态规律特征研究

赵 璐，张慧玲，刘佳雯，达 哇，张永栋

(青海大学附属医院 1. 公共卫生和医院感染管理部； 2. 血液透析中心，青海 西宁 810001)

透析用水易受微生物污染，常见为革兰阴性杆菌。革兰阴性杆菌死亡后会产生、释放内毒素，机体反复暴露于内毒素会诱发炎症反应，其特征是脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)促炎细胞因子的产生，从而导致血透患者机体长期受到慢性炎症等影响[1-2]。近年来很多研究通过改进透析器膜，解决患者感染风险，如国外开发由聚醚砜、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和活性炭组成的混合基质膜(MMM)，体外试验结果表明对细菌过滤效果优良[3]。而透析用水的质量才是杜绝细菌热原污染的根源所在。透析用水消毒方式以热消毒和化学消毒为主。热消毒通过短时间将水温提高并进行热冲洗，达到恒温后热循环在管路中达到消毒作用，而化学消毒主要使用过氧乙酸等消毒剂，有效阻止细菌在水中增殖生长[4-5]。虽然消毒可以有效阻菌，但是不能彻底消灭透析用水水路中的微生物及相关物质，如洋葱伯克霍尔德菌易在供水系统、滤膜和消毒剂中生长[6]。同时日常监测仅定期监测透析用水的污染情况，相关规范对于透析水路管理中细菌及内毒素均有采样检测时间和限值要求。但不同消毒模式下透析用水中细菌和内毒素含量动态变化缺少监测和分析。

本研究基于水路消毒系统模式下不同的物理参数及温度，确定透析用水动态监测的温度和时间间隔。预测微生物学是一门交叉学科，利用微生物和计算机方法预测微生物在系列环境条件中消长的情况。通过Origin软件的数据拟合，应用微生物模型曲线描述透析用水微生物指标存活和变化规律[7]，了解透析用水中细菌和内毒素含量在消毒过程中动态变化和持续情况，旨在细化消毒监测管理，优化水质安全控制。

1 材料与方法

1.1 材料 封闭式薄膜过滤器，硝酸纤维素滤膜(孔径0.22 μm，直径50 mm)， 胰化蛋白胨葡萄糖培养基(TGEA)(HBPM8573-1，规格9 cm×10 cm)，BIOBASE多功能恒温箱(型号BJPX-100)，革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒(喜诺生物医药)(EKT-13M、25M)，细菌内毒素测定仪(IGL-800)，一次性无热原采样试管(PSB210104，规格：9 mm×65 mm)，鲎试剂(喜诺生物医药)，脂多糖标准品(购于SIGMA-ALDRICH，成份LPS fromEscherichiacoliO111∶B4，蛋白含量小于3%)。

1.2 水样采集方法

1.2.1 采样点 透析用水采样点为回水口(输水管路末端)或混合室入口处(透析机与输水回路连接部位U型采样口)。因热消毒的加热和PHD循环程序、化学消毒的消毒剂浸泡程序运行时回水口阀门关闭，两个消毒程序过程均采集了整个输水管路三个不同部位的混合室入口处，即首机(使用频率低的1床过渡透析机)、中间机(管路中间并第二个加热组件部位对应透析机位)、尾机(最后一台透析机),见图1。

1.2.2 采样方法 用75%乙醇棉签先消毒采样口内外表面后放水60 s，采集至无菌无热源容器中，过程遵循无菌操作原则。每份供试液水样采集80 mL，所需用量细菌培养50 mL，内毒素测定10 mL。

1.3 采样时机 (1)热消毒程序前管路的基础情况、热消毒程序(程序启动开始、加热升温冲洗、PHD热循环、冷却排放、系统关闭)、持续消毒完成后共20 h。热消毒设备在加热期间管路的不同位置有热敏显示器监测水温，初始水温作为动态温度的起始点20℃，采样温度为20～90℃，每间隔10℃。进行3次重复试验，每次重复采集、检测同采样点同温条件下3个单独水样(n=9)，试验结果计算取平均值。(2)化学消毒程序前管路的基础情况、化学消毒程序(程序启动开始、冲洗加入消毒剂、循环、浸泡、冲洗、反复冲洗、系统关闭)、持续消毒完成后共20 h。水温基本稳定17～20℃，采样时间为0～195 min，每间隔15 min。进行3次重复试验，每次重复采集检测同采样点同时间点3个单独水样(n=9)，试验结果计算取平均值。

1.4 细菌培养方法 参照YY 0572—2015标准，采用滤膜过滤法富集，水样取量50 mL，富集在滤膜上。富集时保持液体全部覆盖滤膜表面，过程中保证滤膜在过滤前后的完整性，避免污染，同时设立阴性对照。将滤膜放在TGEA培养皿上20℃恒温培养7 d后进行菌落计数，单位为CFU/mL[8]。

1.5 内毒素测定 依据《中国药典》动态比浊细菌内毒素检查法。检测反应混合物的浊度达到某一预先设定的吸光度或透光率所需要的反应时间，可准确测定透析用水中细菌内毒素含量。细菌内毒素标准品溶解稀释建立标准曲线及可靠性试验，将内毒素标准质控品用纯水溶解，稀释成5个不同浓度，消除干扰，用真菌/细菌动态检测仪进行检测，以稀释度为自变量，以每个浓度测定结果均值为因变量绘制工作标准曲线，回收率为75%～125%。

1.6 数据拟合分析 通过Origin(2017版)软件进行数据模型拟合，两种消毒模式下不同时间或温度下细菌含量变化使用logistic模型拟合，logistic模型是典型的预测模型，描述微生物数量随着时间变化的情况[9]。用于微生物生长和失活情况拟合效果良好。采用细菌存活率描述透析用水中细菌含量变化[10]，计算公式如下：ηh=Nt/N0(ηh细菌的存活率，Nt为不同时间对应的水中细菌含量，N0为消毒前初始水中细菌含量)，对存活率与各时间进行对数非线性logistic模型拟合。不同消毒模式下内毒素随着时间或温度变化的情况使用高斯(Gauss)函数进行数据拟合。

2 结 果

2.1 两种消毒模式下透析用水中细菌存活率对数与观察时间关系 消毒前透析用水中细菌初始含量：热消毒、化学消毒分别为2.46、3.06 CFU/mL。两种消毒模式观察时间均选择为180 min。消毒处理对透析用水中细菌存活影响显著，两种消毒模式细菌存活率对数与消毒程序时间的关系呈现相似曲线特征，细菌存活率随着消毒程序时间的增加而减少，在50～160 min时，细菌存活情况变化幅度大，热消毒细菌含量减少的变化比化学消毒平缓，见图2。

上述由logistic模型拟合结果的方程及其参数，方程为：

(1)

式中t为消毒处理时间(min)，A1、A2、t0、p为模型的参数，见表1。热消毒和化学消毒的曲线决定系数(R2)分别为0.982 84、0.988 37。R2越接近1，拟合效果越好，图1模型曲线拟合效果均良好。

表1 两种消毒模式下细菌存活率对数与观察时间关系拟合方程的相关参数

2.2 热消毒程序过程中透析用水中内毒素含量与温度变化关系 采集输水管路首尾、中间分布的三个混合室入口部位的透析用水中内毒素与温度的关系曲线特征变化基本一致。内毒素含量随着温度不断上升而增加，随着冷却温度下降而减少。在70、80℃时整个管路水中内毒素含量最高。首机处(第一台透析机)内毒素含量整体水平高于中间机和尾机，中间机和尾机处的内毒素含量高峰对应的温度略低于首机处温度。尾机处内毒素含量在冷却后30～20℃趋于平稳。见图3。

上述拟合结果的方程及其参数，方程为：

(2)

式中x为消毒程序中的温度变化对应标值，A、w、y0、xc为模型的参数，见表2。首机、中间机、尾机混合室入口处内毒素曲线的决定系数(R2)分别为0.968 59，0.812 31、0.795 24。R2越接近1，拟合效果越好，图3函数曲线拟合效果均良好。

表2 热消毒模式下透析用水内毒素含量与温度变化拟合方程的相关参数

2.3 化学消毒程序过程中透析用水中内毒素含量与时间变化关系 采集输水管路首尾、中间分布的三个混合室入口部位的透析用水中内毒素与时间的关系曲线特征变化基本一致。内毒素含量集中升高在中间时段，之后随着时间的延长内毒素含量下降并趋于平稳。在80～120 min消毒程序中的消毒剂浸泡冲洗时间段，整个管路水中内毒素含量最高，其中首机处内毒素值最高。中间机内毒素含量整体水平高于尾机，中间机和尾机处的内毒素含量高峰对应的时间略早于首机处。三处内毒素含量在冲洗阶段后趋于平稳。见图4。

上述拟合结果的方程及其参数，方程同2.2中方程(2)，式中x为消毒程序时间(min),A、w、y0、xc为模型的参数，见表3。首机、中间机、尾机三条曲线的决定系数(R2)分别为0.819 30、0.521 38、0.947 61。R2越接近1，拟合效果越好，图4中间机的函数曲线拟合稍差，其余两条曲线拟合效果良好。

表3 化学消毒模式下透析用水内毒素含量与时间变化拟合方程的相关参数

2.4 两种消毒程序下20 h内透析用水中内毒素含量变化 两种模式下内毒素在消毒程序内均随时间增加而升高，随后下降到较低的值趋于平稳，热消毒后到15 h时稍有上升后下降，化学消毒后水中内毒素到12 h时有逐渐上升趋势。见图5。

上述拟合结果的方程及其参数，方程同2.2中方程(2)，式中x为消毒程序时间(min)、A、w、y0、xc为模型的参数，见表4。热消毒和化学消毒曲线的决定系数(R2)分别为0.976 97，0.720 97。R2越接近1，拟合效果越好，图5函数曲线拟合效果良好。

表4 两种消毒模式下透析用水内毒素含量与时间变化拟合方程的相关参数

3 讨 论

临床上使用的透析用水虽经过反渗处理，但多数研究证明存在不同程度的污染情况，如细菌、内毒素、细菌来源的DNA短片段等大中分子物质，并且这些片段及分子物质可能通过透析器膜，从而诱导患者炎症细胞产生，导致慢性炎症及并发症发生及进展[11-12]。透析用水的质量保障在于水路系统的消毒维护。日常按有关规范对透析用水的微生物指标定期抽样监测，对管路中消毒前后微生物及产物的动态特征定量观察也是监测工作中的重要部分。

细菌含量变化规律初级模型拟合显示，虽热消毒比化学消毒的程序时间长，但细菌存活率与消毒程序时间的关系呈现相似曲线特征，说明两种消毒处理对透析用水中细菌存活影响均较为显著。两条曲线50～160 min时间段细菌含量变化幅度较大。在不同消毒程序下，化学消毒比热消毒使细菌存活率略低。绝大部分细菌死亡，结果发现即使消毒完毕无法达到100%除菌。

本研究结果显示，内毒素含量变化对温度和过氧乙酸浸泡敏感，但两种消毒过程中内毒素变化规律存在明显不同。热消毒机组有2个加热组件，通过将水温逐渐加热并冲洗，后至恒温85～90℃，管路在程序升温和冷却环节热敏显示温度是不均衡的，所以使用管路中3个部位的水样拟合，综合说明整个管路真实情况。高斯函数拟合结果显示，3个部位的内毒素与温度的关系曲线特征变化基本一致。内毒素含量随着温度不断上升而增加，水温热冲击短时间可杀死细菌，同时释放大量内毒素，在升温过程中50、60℃仍有细菌存活，一些细菌存活温度稍高并且细菌死亡率的倒数(D值)高，如乳杆菌、假单胞菌等[13]。在70、80℃时整个管路水中内毒素含量最高。首机处内毒素含量整体水平高于中间机和尾机，因为过渡机使用频率低，微生物污染情况相对较重。中间机和尾机处的内毒素含量高峰对应的温度略低于首机处温度，是因为热水先流至首机，温度监测时发现中间和尾机的温度上升比首机慢，同时也说明内毒素释放对温度敏感。化学消毒拟合3个采样部位内毒素与时间的变化关系曲线特征，结果显示随着消毒剂作用时间内毒素先达到释放峰值后下降。在80～120 min消毒程序中的过氧乙酸浸泡冲洗时间段，整个管路水中内毒素含量最高，其中首机处内毒素值最高释放晚于中间和尾部管路部位，但在短期集中快速释放。再次证明过渡机的污染情况可能严重。中间机和尾机处的内毒素含量高峰对应的时间略早于首机处，因浸泡完冲洗管内水流速约为1 400 L/H，冲流积累可使管路后端内毒素含量略高于首机，并且在冲洗阶段后3处内毒素含量均趋于平稳。化学消毒程序中浸泡冲洗环节对内毒素释放影响明显。

观察刚消毒完后内毒素的持续释放情况，结果显示内毒素在两种消毒程序内均随时间增加而升高，随后下降趋于平稳，而热消毒后15 h时、化学消毒后12 h水中内毒素有逐渐上升趋势，出现小峰值。本研究中涉及机组基本情况为供水管路和消毒机组管路较新，使用年限仅一年十个月，输水管路很长。消毒机组管路为316不锈钢材质，供水管路为交联聚乙烯(PEX)材质。虽标准YY 0572—2015中规定透析用水中的内毒素含量应不超过0.25 EU/mL，干预水平为0.125 EU/mL。但在临床实践中，因供水分配系统的复杂性和输水热损失、水流波动性，会造成热消毒、化学消毒效果的不均衡性[14]。尤其是加热组件远端水路、使用点的热损失，还有出口、管路拐点消毒浸泡冲洗短暂或易停滞的情况发生。因管路较新，内毒素没有超过限值，但在消毒过程中个别点却达到干预值。结合细菌存活率试验结果，可能与细菌系统再定植有关。在消毒刚完成的次日，需要关注患者上机前制水系统的管理和及时更换快超期透析机内毒素过滤器是必要的。

透析用水的供水系统为相对封闭的环境，管道系统中的水流，以及系统本身的设计和性质也可能影响微生物指标，如管道系统很可能藏匿着以生物膜方式生活的病原体细胞等[15-16]。应用模型拟合曲线描述透析用水中细菌失活和内毒素释放变化，模型基于函数方程，y因变量在研究中为(细菌存活率对数、内毒素含量)而随不同温度和时间而变化。除化学消毒下中间机的内毒素与时间曲线外，其余曲线估计的R2值为0.720 97～0.988 37，数据的统计拟合基本良好。说明所选函数模型能够充分描述透析用水中细菌和内毒素动态变化特征。消毒全过程中温度和时间是影响透析用水微生物指标决定性的参数。

本研究利用微生物数据模型拟合数据，用于描述透析用水中细菌失活和内毒素变化规律，补充细化透析用水监测方法。但本研究存在一定的局限性，即模型基于一家医疗机构的数据拟合而成，虽然为本省规模大的血透中心，有一定的参考性，但是缺少多样本完善数据。同时本研究建立的微生物预测模型为初级，而完善的模型需要长期、重复的过程，并且建立高级模型，在日后的研究准备扩大样本、丰富试验设计、完善修正数据模型。在日常感控工作中，可根据医疗机构血透中心的基本情况，摸底绘制自身消毒过程下管路水中微生物指标变化规律曲线。在传统监测上增加方法，动态分析微生物指标的变化有助于更好地达到透析用水消毒效果，细化预防与控制措施。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。