UPLC-Q-TOF-MS/MS 法定性分析丹膝颗粒的化学成分

刘灿黄，章泽恒，汪辉，何清彦，蒋桃，黄胜

1.长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410208；2.湖南省药品审评认证与不良反应监测中心，湖南 长沙 410013；3.湖南食品药品职业学院，湖南 长沙 410208；4.九芝堂股份有限公司，湖南 长沙 410205

丹膝颗粒收载于《中国药典》2020 年版一部［1］，为九芝堂独家生产品种，全方由丹参、牛膝、天麻、牡丹皮、赤芍、川芎、生地黄、淫羊藿、桑寄生、栀子、决明子、火麻仁十二味药材组成。丹膝颗粒原名“偏瘫灵颗粒”，临床上对阴虚风动型和气虚血瘀型中风偏瘫有其特有的预防和治疗优势。处方中以丹参、牛膝为君药，活血祛瘀，通经止痛，补肝肾强筋骨；赤芍、生地黄、牡丹皮清热凉血、养阴生津、散瘀止痛，共为臣药；淫羊藿、桑寄生、天麻、川芎、栀子共为佐药，增强君药补肝肾强筋骨、活血通经、清热除烦的作用，方中决明子、火麻仁清肝明目，润肠通便。丹膝颗粒原质量标准建立了丹参、牛膝、淫羊藿、栀子、决明子的薄层色谱鉴别和丹酚酸B、天麻素的含量测定方法，薄层色谱和含量测定项目多而且前处理方法繁杂，本研究前期在43 批次样品分析的基础上，多方法条件摸索，将复方中17 种成分作为目标成分进行整体评价分析，建立了丹膝盖颗粒HPLC-DAD-ELSD指纹图谱多指标成分控制模式。为促进丹膝颗粒药用功效的二次开发，进一步研究丹膝颗粒复方制剂的化学成分和物质基础，本研究中采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用方法（UPLC-Q-TOFMS/MS），更为快速、简便、全面地分析丹膝颗粒中化学成分。

UPLC-Q-TOF-MS/MS 具有高分辨率、高灵敏度、周期短、扫描范围广等特点，是研究中药复杂体系中化学成分和定性分析的重要工具。本研究通过将MS/MS 扫描的碎片离子信息和化合物裂解规律与对照品或文献比对来快速地分析其所含的化学成分，为加强丹膝颗粒整体质量控制、阐明药效物质基础、分析药效机制提供参考。

1 仪器与试药

超高效液相色谱仪（Agilent 1290），质谱仪（Agilent Q-TOF 6545），数据分析软件（Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.08.00），XS205DU电子天平（瑞士Mettler Toledo），SB-800DTD 超声仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

对照品：没食子酸（批号110831-201906，91.5%），天麻素（批号110807-202010，95.5%），栀子苷（批号110749-201718，97.6%），丹酚酸B（批号110562-201917，96.6%），淫羊藿苷（批号110737-202017，98.1%），丹皮酚（批号110708-201908，99.8%），丹 参 酮ⅡA（批 号110766-202022，98.9%），β-蜕皮甾醇（批号111638-201907，97.9%），芍药苷（批号110736-201943，95.1%），丹参素（批号20101，99.3%），人参皂苷Ro（批号20051，96.0%），橙黄决明素（批号20031，98.0%），朝藿定A（批号20121，96.0%）。朝藿定B（批号20121，96.0%），朝藿定C（批号20051，96.0%），梓醇（批号20051，98.0%），地黄苷D（批号20121，98.0%），天麻素（批号110807-202010，96.7%），阿魏酸（批号110773-201915，99.4%），大黄酚（批号110796-201922，99.4%），大黄素（批号110756-201913，96.0%），丹参素、人参皂苷Ro、橙黄决明素、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、梓醇、地黄苷D 对照品购自珠海安哲生物科技有限公司，其余对照品购自中国食品药品检定研究院。

色谱纯乙腈（Fisher，美国，071757），甲醇（Fisher，美国，154449），甲酸（CNW，德国，3208K240）、纯净水（怡宝），丹膝颗粒（九芝堂股份有限公司，批号20190104，20190307，20190401，规格：每袋装10 g，）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备称取天麻素、没食子酸、丹参素、原儿茶醛、栀子苷、芍药苷、阿魏酸、β-蜕皮甾醇、丹酚酸B、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、丹皮酚、人参皂苷Ro、橙黄决明素、大黄素、大黄酚、丹参酮ⅡA、地黄苷D、梓醇共21 种对照品适量，加甲醇制成浓度分别为5 μg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备取丹膝颗粒，研细，取粉末约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定重量，超声提取（功率250 W，频率40 kHz）45 min，滤过，续滤液用0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.2 液相色谱条件

采用Atlantis® T3 色谱柱（2.1 mm×250 mm，5 μm）；柱温为35 ℃；体积流量为0.4 mL/min；检测波长为254 nm；进样量2 μL；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，5%A；5～45 min，5%A →40%A；45～55 min，乙腈40%A →85%A；55～58 min，85%A →5%A）。

2.3 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正负离子模式监测，扫描范围m/z 100～1 100，毛细管电压3 500 V，毛细管出口电压175 V；干燥气（N2体积流量8 L/min；干燥器温度320 ℃，雾化器压力35 psi）。裂解电压为120 V，碰撞能量分别为10、20、40 eV。TOF-MS/MS 扫描范围m/z 30～1 000，开启动态背景扣除（DBS）。

2.4 统计学方法

实验数据采用Masshunter Qualitative Analysis B.08.00处理。

2.5 结果与分析

按“2.2”项下色谱条件和“2.3”项下质谱条件，分析供试品溶液，正负离子扫描模式下总离子流图见图1。查阅《中药质量现代分析技术》、国内外相关文献资料，参考TCMSP 数据库，结合各对照品质谱信息，特征碎片离子，色谱保留时间的信息，与本研究中检测到的丹膝颗粒化学成分的相关信息进行比较，共鉴定和推测出102 种化学成分，见表1。

图1 负离子（A）、正离子（B）模式下丹膝颗粒的总离子流图（TIC）

表1 UPLC-Q-TOF-MS/MS质谱数据

表1 （续）

表1 （续）

下面举例说明丹膝颗粒中主要化学成分的质谱裂解规律推测过程。

2.5.1 酚酸类化合物在已有文献的基础上结合预实验结果在负离子模式下进行酚酸类成分分析［23-24］，酚酸类化合物主要来自丹参、川芎、赤芍等。主要有单体的丹参素和咖啡酸，缩酚酸类的丹酚酸A、B、C、E 以及迷迭香酸等。根据文献总结的质谱规律结合实验质谱信息可发现，酚酸类化合物主要含有羰基、羧基和羟基，在质谱碰撞中易丢失CO、CO2、H2O 等中性碎片。如化合物5 丹参素，负离子给出准分子离子峰m/z 197.045 5［M-H］-（C9H10O5），在TOF-MS/MS 中，脱去一分子H2O 形成m/z179.035 4，再脱去一分子CO2形成 m/z 135.045 8，丹参素分子中的CH（OH）和 COOH 部分与母环中苄基碳碎裂形成碎片离子 m/z 72.993 5，经与对照品相比较，化合物5 确认为丹参素，推测丹参素的裂解途径见图2。

图2 丹参素质谱裂解规律

丹参素和咖啡酸作为水溶性酚酸类化合物的一个基本母核，其他的水溶性酚酸类化合物大多为这二者的聚合或者缩合产物，质谱中通常发生对应丢失丹参素、咖啡酸和脱水咖啡酸等裂解规律，主要为缩酚酸类的成分在质谱碰撞中丢失［M-H-180］和［M-H-198］中性碎片即丢失不同分子的丹参素和咖啡酸，根据以上的中性丢失和特征性碎片可以实现对酚酸类化合物的快速分类及鉴定。如化合物58 丹酚酸B，其结构中含有2 个丹参素片段。负离子给出准分子离子峰m/z 717.145 1［M-H］-（C36H30O16），在 TOF-MS/MS 中，分别失去1 分子和2 分子的丹参素得到碎片离子m/z 519.093 5［M-HC9H10O5］-和m/z 321.041 1［M-H-2（C9H10O5）］，少数m/z 519.093 5 发生麦氏重排，失去180，得到碎片m/z 339.051 1，随后侧链断裂，产生碎片m/z 295.061 8，有些继续失去一分子H2O，产生碎片m/z 277.048 7，另外也可见到与丹参素相同的碎片离子峰m/z 179.035 4、135.045 8。经与对照品相比较，化合物58 确认为丹酚酸 B，推测丹酚酸B 的裂解途径见图3。

图3 丹酚酸B质谱裂解规律

2.5.2 黄酮类化合物黄酮类化合物是一类基本母核为2-苯基色原酮的化合物，以游离形式、与糖结合成苷类或以碳糖基的形式存在。黄酮类化合物具有相同的母核，该类化合物在质谱条件下有相似的裂解规律，主要发生糖链、侧链的裂解和脱水。本研究丹膝颗粒中黄酮类化合物主要来自淫羊藿、桑寄生、牡丹皮等。淫羊藿的异戊烯基类黄酮化合物为其主要活性成分，如淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定 B 和朝藿定C 等，该类化合物在裂解过程中容易发生脱糖基、脱水、环的RDA 裂解以及CO、CO2、CHO 等一些中性分子丢失［25-26］，在负离子模式下，异戊烯基取代的黄酮类成分易失去糖基产生基峰离子，而苷元离子较难进一步裂解。可将苷元离子作为鉴别该类化合物的特征离子。以化合物67 朝藿定A 为例，［M-H］-离子m/z 837.285 4，分子式为C39H50O20，失去1 分子葡萄糖形成基峰离子m/z 675.232 5 ［M-H-glu］-离子，离子m/z 675.232 5 同时失去1 分子葡萄糖和鼠李糖后产生母核离子m/z 367.267 8［M-H-glu-glu-rha］-。与朝藿定A 对照品比较，推测朝藿定A 的裂解途径见图4。

2.5.3 醌类化合物醌类化合物是一类具有醌式结构的化学成分，主要分为苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌4 种类型，结合文献和预实验［27］，丹膝颗粒中醌类化合物主要来源于决明子、丹参，决明子中醌类化合物主要为游离和结合蒽醌类、萘并吡喃酮类及其苷类。蒽醌类化合物母核结构主要为大黄素型，结构较稳定，蒽醌母核上常有羟基、羟甲基、甲基、甲氧基及羧基取代，同时以游离形式与糖结合成苷的形式存在。结合蒽醌所结合糖的类型主为葡萄糖和龙胆二糖。萘并吡喃酮类成分也是本研究丹膝颗粒中来自决明子的一类特异性成分，多以苷的形式存在，糖类型以吡喃葡萄糖和龙胆二糖为主，有决明子苷、红镰霉素-6-O-β-D-葡萄糖苷、红镰霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷等。本研究丹膝颗粒中蒽醌类化合物有大黄素、大黄酚、大黄素-6-O-β-D-葡萄糖苷、橙黄决明素等。该类化物的分子骨架存在共轭体系，比较稳定，不易断裂，其质谱裂解主要发生在侧链取代基的断裂，如糖基、甲基、甲氧基等，或丢失母核基团中的CO，留存共轭体系。以化合物79 橙黄决明素为例，游离醌依次脱去2 个分子-CH3分别得到m/z 314.042 3 和m/z 299.018 6 碎片，以m/z 299.018 6 为母离子失去-CO可得到m/z 271.024 9 离子，或者通过失去-CH2可得到m/z 285.041 3离子。与橙黄决明素对照品比较，推测橙黄决明素的裂解途径见图5。

图5 橙黄决明素质谱裂解规律

2.5.4 萜类化合物萜类化合物由甲戊二羟酸衍生而成，基本碳架多具有2 个或2 个以上异戊二烯单位结构特征。以单萜、二萜、三萜及倍半萜等形式存在，在丹膝颗粒中主要来自赤芍、牡丹皮、丹参、栀子等药材。萜类通常在负离子模式下响应较好，母离子主要以［M-H］-或［M+COOH］-形式存在，碎片离子以丢失糖配基较为常见。赤芍和牡丹皮中单萜及其苷类化合物主要为具蒎烷结构和具内酯结构的单萜及其苷类［28］。如芍药苷、去苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷等。以芍药内酯苷和芍药苷为例。首先根据 TOF-MS 给出的分子离子峰525.161 5，与芍药苷或者芍药内酯苷的加甲酸峰一致，初步推测其为芍药苷或者芍药内酯苷，分子式为C23H28O11。化合物19 裂解二级质谱图上m/z 479.154 6 峰为其分子离子峰，由于芍药内酯苷结构中存在一个内酯环，其酰氧基两侧均可发生断裂，失掉一分子CO2得到m/z 435.144 4。而碎片m/z 357.118 0 为准分子离子峰失去一分子苯甲酸形成，m/z 121.029 3 为失掉的一分子苯甲酸碎片离子。初步鉴定该化合物为芍药内酯苷，推测其裂解途径见图6。

图6 芍药内酯苷质谱裂解规律

化合物23 裂解质谱图上m/z 449.145 0 为分子离子峰（m/z 479.155 9）蒎烷骨架失去一分子CH2O重排离子［M-H］-峰，继而进一步失去1 个苯甲酸形成m/z 327.109 4 离子峰，m/z 165.055 4 为蒎烷基本骨架结构的碎片，由于蒎烷骨架上与一苯甲酰取代基相连，m/z 121.028 0 为失掉的一分子苯甲酸碎片离子。经与芍药苷对照品比较，确定该化合物23 为芍药苷，推测其裂解途径见图7。

图7 芍药苷质谱裂解规律

3 讨论

本研究首次利用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术，利用TOF-MS/MS、XIC、BPC 提取功能，利用精确分子质量数，推测分子结构，参考文献，参照对照品，对比化合物质谱信息，获取二级质谱图。对丹膝颗粒成分进行定性分析，初步表征了该复方中102 个化学成分，除上述举例说明的酚酸类、黄酮类、醌类、萜类等化合物外，还有丹参的二萜醌类丹参酮类、牛膝的甾酮类、栀子的环烯醚萜类等，实验中对丰度较高的化合物如芍药苷、栀子苷、丹酚酸B、丹皮酚、淫羊藿苷等用对照品进行了确证。原质量标准中用薄层色谱法定性鉴别丹参、牛膝、淫羊藿、栀子、决明子，前处理方法繁杂时间长，本方法快速简便，且相对全面反映了丹膝颗粒的化学成分。

研究中生产企业反馈原标准中对大黄素、大黄酚的薄层色谱鉴别项目经常出现斑点不明显的情况，从本研究中发现，丹膝颗粒加甲醇超声处理后能检出有游离大黄素、大黄酚，还有结合型大黄素-6-Oβ-D-龙胆二糖苷、大黄素-6-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-β-D-四吡喃葡萄糖苷、大黄酚-1-Oβ-D-龙胆二糖苷等。原薄层色谱鉴别方法中样品加乙酸乙酯、盐酸回流水解取滤液，样品加乙酸乙酯、盐酸后结团不能充分水解，而原样品游离大黄素、大黄酚含量低，推断薄层色谱鉴别斑点不明显主要源于对样品的水解前处理因素的影响。

本研究所鉴定和推测的102 个成分中，19 个成分来自丹参、7 个来自牛膝，15 个来自淫羊藿，22个来自决明子等。为丹膝颗粒进一步的药理作用研究提供了研究基础。