鬼针草水提物抗伪狂犬病毒作用研究

郭志军，谢慧凡，吴其文，陈洪博,3，邱龙新,3

(1 龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩 364012；2 福建龙岩闽雄生物科技股份有限公司，福建 龙岩 364012；3 预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室，福建 龙岩 364012)

鬼针草(BidenspilosaL．)为一年生菊科鬼针草属植物，俗称婆婆针，在我国主要分布于华南、华东及华中地区[1]，为民间常用中草药，主治感冒、高血压、痢疾、肝炎、胃肠炎、胰腺炎等多种疾病[2-5]。其主要药效成分包括黄酮、多炔、挥发油、有机酸等[6]。研究表明，鬼针草提取物具有抗炎[7]、抗氧化[8]、抗损伤[9]等多种活性。

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PrV)属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其DNA长度约为145 kb，编码的蛋白主要包括gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK、gL、gM和gN等10种囊膜结构蛋白和分泌蛋白gG[10-12]。PrV对外界环境的抵抗力较强，55 ℃ 50 min或80 ℃ 3 min才能将其杀灭，100 ℃可瞬间杀灭；对氯仿、酒精、乙醚等有机溶剂敏感，对福尔马林和紫外线非常敏感；在pH 4.0～12条件下，PrV稳定，甚至在 pH 2.0和pH 13.5条件下，需2～4 h才能完全灭活。PrV可使怀孕母猪发生流产、产死胎或木乃伊胎等，引起公猪不育及新生仔猪体温升高、呕吐、腹泻、共济失调、神经症状，严重时可大量死亡，是危害全球养猪业的重大传染病之一，当前没有有效的治疗方法，只能通过疫苗免疫和注射高免血清降低死亡率[13-14]。研究报道，鬼针草提取物具有抑制甲型和乙型流感病毒的作用[15]，目前有关鬼针草抗PrV的研究尚未见报道。本研究从体外细胞水平探讨了鬼针草水提物抗PrV的效果及其作用机制，以期为鬼针草的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鬼针草，由龙岩学院生命科学学院植物教研室鉴定保存；仓鼠肾上皮细胞(BHK-21)，来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；伪狂犬病毒，由龙岩学院预防兽医学与生物技术福建省高校重点实验室分离保存；PrV gB多克隆抗体，为北京金诺诊断生物公司的PrV gB检测试剂盒阳性血清；胎牛血清，购自Biological Inustries公司；DMEM高糖培养液，购自Hyclone Laboratories,Inc.；Annexin-V(FITC)/PI细胞凋亡试剂盒和增强型CCK-8试剂盒，购自碧云天生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Goat anti pig IgG-FITC抗体，购自Abcam公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)，购自Roche公司。

1.2 鬼针草水提物(BPE)的制备

将鬼针草粉碎后过孔径0.355 mm(50目)的筛，取10 g粉末加入200 g蒸馏水浸泡3 h，大火煮沸10 min后，改小火煎煮2 h后过滤，收集滤液，滤渣加10倍质量的蒸馏水，大火煮沸10 min后改小火煎煮2 h，过滤收集滤液，合并2次滤液，用旋转蒸发仪浓缩至10 mL。向上述鬼针草水提物中加入无水乙醇至其最终体积分数为70%，调整pH值为7.0～7.4，在4 ℃冰箱浸提48 h，过滤，滤液用旋转蒸发仪回收乙醇，上清液经减压浓缩后真空冷冻干燥，收集冻干粉备用。将冻干粉用DMEM培养液溶解，调整鬼针草质量浓度为640 mg/mL(以生药计)，用0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用。

1.3 PrV组织半数感染量(TCID50)的测定

将生长状态良好的BHK-21细胞(密度为1×105mL-1)接种到96孔细胞培养板，每孔100 μL，12 h后弃培养液加入100 μL 10-1～10-8稀释的Prv病毒液，每个稀释度做8个重复，以正常的BHK-21细胞作为阴性对照，将细胞培养板放在37 ℃ 、体积分数5% CO2的细胞培养箱中培养，孵育1 h后，弃去培养液，换用含体积分数2%胎牛血清的细胞培养液继续进行培养，逐日观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)情况，统计病变孔数(阳性孔数)和未发生病变孔数(阴性孔数)，按照Reed-Muench法[16]计算病毒的TCID50。

1.4 BPE的细胞毒性检验

调整BHK-21细胞密度为1×105mL-1，加入96孔培养板中，每孔100 μL，在37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养12 h，加入640 mg/mL的BPE，作连续2倍稀释至鬼针草生药质量浓度为1.25 mg/mL，并设药物空白孔和细胞对照孔，每个质量浓度做8个重复，培养48 h，加入CCK-8溶液10 μL/孔，置于CO2培养箱中孵育1 h，用酶标仪于450 nm处测定吸光度值(OD450)，计算BPE半数中毒浓度(TC50)，并确定BPE最大无毒浓度(TC0)[17]。

1.5 BPE体外对PrV的半数抑制质量浓度(EC50)

调整BHK-21细胞密度为1×105mL-1，加入96孔培养板中，每孔100 μL，在37 ℃体积分数5% CO2的培养箱中培养12 h，加BPE使其终质量浓度为TC0(10 mg/mL)，2倍倍比稀释至BPE为0.625 mg/mL，每孔接种病毒含量为100×TCID50的PrV病毒液100 μL，吸附1 h后移除上清液，换用含体积分数2%胎牛血清的细胞培养液继续培养。试验同时设药物空白组、细胞对照组、阳性对照组和PrV对照组。用显微镜观察各组培养物，当PrV对照组细胞病变率大于75%时停止孵育，每孔加10 μL CCK-8染色液，培养箱中作用1 h，用酶标仪测定OD450,计算BPE对PrV的半数抑制质量浓度(EC50)[17]。

计算治疗指数(therapeutic index，TI)： TI=TC50/EC50。TI作为评价药物抑制病毒感染的安全性指标,其值越大药物越安全，TI≥2表示有效低毒，1

1.6 BPE体外抗PrV机制检测

1.6.1 对PrV的阻断作用 调整BHK-21细胞密度为1×105mL-1，加入96孔培养板中，每孔100 μL，在37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养12 h后，分为10，5，2.5 mg/mL BPE组和0.5 mg/mL伐昔洛韦组，各组先用相应的药物处理细胞4 h，弃上清液，然后均接种100×TCID50的PrV病毒液 ，100 μL/孔，吸附1 h后移除上清液，换为含体积分数2%胎牛血清的细胞培养液继续培养，每个质量浓度6个重复，试验同时设细胞对照组和PrV对照组，待PrV对照组细胞80%出现病变时用CCK-8试剂盒测定细胞存活率。

1.6.2 对PrV的抑制作用 将100×TCID50的PrV病毒液加入到长满单层BHK-21细胞的96孔培养板中，100 μL/孔，在37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中吸附1 h，移除病毒液，用PBS清洗3次，分为10，5，2.5 mg/mL BPE和0.5 mg/mL伐昔洛韦组，各组分别加入相应药物100 μL继续培养，每个质量浓度6个重复，试验同时设细胞对照组和PrV对照组，待PrV对照组细胞80%出现病变时用CCK-8试剂盒测定细胞存活率。

1.6.3 对PrV的直接灭活作用 将1 mL 100×TCID50的PrV病毒液分别与1 mL 10，5，2.5 mg/mL BPE或0.5 mg/mL伐昔洛韦混合，4 ℃冰箱放置2 h。将上述处理后的PrV病毒液加入到长满单层BHK-21细胞的96孔培养板中，在37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中吸附1 h后，移除病毒液，用PBS清洗3次，加入含体积分数2%胎牛血清的细胞培养液100 μL继续培养，每个质量浓度6个重复，试验同时设细胞对照组和PrV对照组，待PrV对照组细胞80%出现病变时，用CCK-8试剂盒测定细胞存活率。

1.7 BPE对PrV所致细胞凋亡的影响

采用间接免疫荧光试验检测BPE对PrV所致细胞凋亡的影响。调整BHK-21细胞密度为1×105mL-1，加入24孔细胞培养板中，每孔1 mL，分为细胞对照组、10 mg/mL BPE、0.5 mg/mL伐昔洛韦组、PrV对照组、10 mg/mL BPE+PrV组和0.5 mg/mL伐昔洛韦+PrV组，每组4个重复。待细胞长满单层时，10 mg/mL BPE和0.5 mg/mL伐昔洛韦组分别加入相应的药物；PrV对照组、10 mg/mL BPE+PrV组和0.5 mg/mL伐昔洛韦+PrV组均先加入100×TCID50的PrV毒液，37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中孵育1 h，移除病毒液，PBS洗3遍，换成含体积分数2%胎牛血清的细胞培养液，后两组分别加入相应的药物，培养48 h。各组细胞弃培养液，用冷PBS洗涤3次，加入195 μL Annexin V-FITC结合液，再加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，加入10 μL PI染色液，轻轻混匀，室温下避光孵育30 min，荧光显微镜下观察。

1.8 BPE对PrV gB基因表达的影响

采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测BPE对PrVgB基因表达的影响。调整BHK-21细胞密度为1×105mL-1，加入六孔细胞培养板中，每孔3 mL，分为PrV对照组、10 mg/mL BPE组和0.5 mg/mL伐昔洛韦组，待细胞长满单层时，3组均加入100×TCID50的PrV毒液，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育1 h，PBS洗3遍，换用含体积分数2%胎牛血清的细胞培养液培养，后两组分别加入相应的药物，培养48 h后提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书操作制备cDNA，备用。以β-actin为内参基因，采用实时荧光定量PCR试剂盒测定PrV病毒gB基因的表达水平。β-actin基因引物为：β-actin-F是5′-ATGGATGATGATATCGCCGC-3′，β-actin-R是5′-GTGTGGTGCCAGATTTCC-3′；PrVgB基因引物为：gB-F是5′-CGGCATCGCCAACTTCTTC-3′，gB-R是5′-GTCCTCCTTGAGCGTCTTCGT-3′。2对引物均由生工生物合成。RT-qPCR反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量[18-20]。

1.9 BPE对PrV gB蛋白表达的影响

用间接免疫荧光试验检测BPE对PrV gB蛋白表达的影响。调整BHK-21细胞密度为1×105mL-1，加入六孔培养板，每孔3 mL，分为细胞对照组、PrV对照组、0.5 mg/mL伐昔洛韦组及2.5，5，10 mg/mL BPE组，待细胞长满单层时,除细胞对照组外的其他组加入100×TCID50PrV病毒液，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育1 h，PBS洗3遍，换成含体积分数2%胎牛血清细胞培养液培养，0.5 mg/mL伐昔洛韦组和2.5，5，10 mg/mL BPE组分别加入相应药物，培养48 h收集样品，PBS洗涤3次，用丙酮甲醇(V(丙酮)∶V(甲醇)=3∶2)溶液固定，在37 ℃培养箱中用50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，一抗PrV gB多克隆抗体(1∶50倍稀释)4 ℃孵育过夜，PBST洗涤后用羊抗猪IgG-FITC抗体(1∶100倍稀释)室温孵育2 h，于荧光显微镜下观察拍照。

1.10 数据处理与分析

试验数据用Graphpad prism 5.0软件进行分析，组间差异性采用单因素方差分析确定。

2 结果与分析

2.1 PrV TCID50的测定

由表1可知，病毒稀释度为10-6时病变孔累积阳性率高于50%，稀释度为10-7时病变孔累积阳性率低于50%，按Reed-Muench法计算得TCID50为10-6.57，即当病毒稀释度为10-6.57时，以0.1 mL接种可使50%细胞感染。

表1 PrV的TCID50测定结果Table 1 TCID50 of PrV

2.2 BPE的细胞毒性及体外抗PrV活性

试验结果显示，BPE对BHK-21细胞的毒性较低，其TC50为28.7 mg/mL，TC0为10 mg/mL。BPE对PrV的EC50为5.16 mg/mL，治疗指数为5.56。结果表明，BPE为有效低毒的药物，对PrV具有一定的抑制活性，有较高的利用价值。

2.3 BPE体外抗PrV作用方式

试验结果如图1所示。

A.阻断方式；B.抑制方式；C.灭活方式。与细胞对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；与PrV对照组相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)，图3同A.Blocking mode;B.Inhibition mode;C.Inactivation mode.Compared with cell control group,*indicates significant difference(P<0.05) and ** indicates extremely significant difference (P<0.01);Compared with PrV control group,# indicates significant difference(P<0.05) and ## indicates extremely significant difference (P<0.01),the same Fig.3 图1 鬼针草水提物(BPE)抗PrV的作用方式Fig.1 Function mechanism of BPE against PrV

由图1-A可知，2.5，5和10 mg/mL BPE和0.5 mg/mL伐昔洛韦处理BHK-21细胞后感染PrV，细胞存活率与PrV对照组无显著差异(P>0.05)，表明BPE抗PrV的机制不是阻断作用。

图1-B表明，与PrV对照组相比，2.5，5和10 mg/mL BPE处理的细胞存活率极显著提高(P<0.01)，且呈剂量依赖性，0.5 mg/mL伐昔洛韦组细胞存活率也极显著提高(P<0.01)，但效果较5和10 mg/mL BPE处理差，表明BPE具有抑制PrV增殖的作用。图1-C表明，与PrV对照组相比，2.5，5,10 mg/mL BPE和0.5 mg/mL伐昔洛韦处理的病毒感染细胞的存活率均极显著提高(P<0.01)，表明BPE具有体外灭活PrV的作用。综上可知，BPE具有灭活PrV和抑制其增殖的作用，其中抑制PrV增殖效果更好。

2.4 BPE对PrV诱导BHK-21细胞凋亡的影响

间接免疫荧光试验中，细胞核被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。BPE对PrV感染诱导BHK-21细胞凋亡影响的荧光显微镜观察结果如图2所示。由图2可知，与细胞对照和10 mg/mL BPE相比，0.5 mg/mL伐昔洛韦组可引起较多的细胞凋亡(图2-A，B，C)；与PrV对照组相比，10 mg/mL BPE和0.5 mg/mL伐昔洛韦可减少因PrV感染引起的BHK-21细胞凋亡数量(图2-D，E，F)，说明BPE可以降低PrV诱导的BHK-21细胞的凋亡率，且安全性优于伐昔洛韦。

2.5 BPE对PrV gB基因表达量的抑制作用

PrVgB基因实时荧光定量PCR检测结果(图3)显示，与PrV对照相比，10 mg/mL BPE组gB基因的表达水平显著降低(P<0.05)，0.5 mg/mL伐昔洛韦组极显著降低(P<0.01)，而BPE和伐昔洛韦两组之间无显著差异。结果表明，10 mg/mL BPE和0.5 mg/mL伐昔洛韦均能抑制PrVgB基因的表达。

2.6 BPE对PrV gB蛋白表达量的抑制作用

BPE对PrV gB蛋白表达的影响如图4所示，2.5 mg/mL BPE+PrV组gB蛋白的黄绿色荧光信号强度降低，5，10 mg/mL BPE和0.5 mg/mL伐昔洛韦+PrV组中均检测不到gB蛋白荧光信号，表明BPE和伐昔洛韦可明显抑制PrV感染的BHK-21细胞gB蛋白的表达，且呈剂量依赖性。gB蛋白在PrV复制中起重要作用，BPE可能通过抑制gB蛋白的表达而抑制PrV的复制。

图3 BPE对PrV gB基因相对表达量的影响Fig.3 Effect of BPE on relative expression of PrV gB gene

A.细胞对照组；B.PrV对照组；C.2.5 mg/mL BPE+PrV组；D.5 mg/mL BPE+PrV组；E.10 mg/mL BPE+PrV组；F.0.5 mg/mL伐昔洛韦+PrV组A.Cell control;B.PrV control;C.2.5 mg/mL BPE+PrV;D.5 mg/mL BPE+PrV;E.10 mg/mL BPE+PrV;F.0.5 mg/mL Valaciclovir+PrV图4 BPE对PrV gB蛋白表达的影响(100×)Fig.4 Effect of BPE on expression of PrV gB protein (100×)

3 讨 论

猪伪狂犬病(porcine pseudoraibies，PR)，是危害全球养猪业的重大传染病之一[10]。我国目前主要通过疫苗接种防控该病，但近年来，PrV呈变异趋势，致病力增强的PrV导致我国多地PR爆发流行，给防控工作带来了挑战。近年来，传统中药因具有经济有效、副作用小的特点而成为兽医临床抗病研究的热点[21-22]。

研究表明，一些清热药、解表药和补益药具有明显的抗病毒作用，其中的黄酮类、多糖、皂苷、蒽酮、生物碱等是抗病毒活性成分。BPE中含有多种黄酮类、挥发油和双咖啡酰类化合物，具有清热解毒，散瘀消肿等作用[2]。鬼针草提取物有抗甲型和乙型流感病毒的作用[15]，与头抱类抗生素有协同作用，可增强动物血清中氨基糖苷类、酞胺醇类以及内酞胺类抗生素联用的体内抗菌作用，体外可抑制金黄色葡萄球菌和枯草芽抱杆菌的增殖[23-25]。本研究发现，BPE对BHK-21细胞毒性较低，对PrV具有一定的抑制活性，表明BPE为低毒有效的药物，有较高的利用价值，能开发成一种新型的防控伪狂犬病毒的药物。

中药抗病毒的机制包括两方面，其一是直接灭活病毒，阻止病毒侵入细胞，抑制病毒繁殖和传播；其二是调节机体免疫功能，提高动物体液及细胞免疫水平，从而达到间接抗病毒作用[26]。本研究结果显示，BPE不影响PrV的吸附侵入细胞过程，可通过抑制PrV增殖和直接灭活作用而发挥抗PrV功效，其中抑制PrV增殖作用效果更好。

PrV gB蛋白参与病毒与细胞的融合，是病毒传播必需的蛋白质，同时gB蛋白又是重要的免疫抗原，可刺激动物机体产生2种综合抗体[27-28]，制备相应的gB抗体检测试剂盒对PR诊断非常重要[29-30]。目前，与gB基因有关的基因工程疫苗和多联苗已研制成功，并运用于临床，但是由于PrV进化导致免疫疫苗的猪群并不能获得完全保护。gB蛋白作为疫苗开发中的抗原之一，在病毒免疫逃避中起一定的作用，所以对于gB基因相关工程苗的研制就变得尤为重要[31]。本研究表明，BPE可通过抑制PrVgB基因和蛋白水平的表达而抑制PrV繁殖及在细胞间传播，也可通过直接杀灭PrV的作用而达到保护BHK-21细胞的目的；BPE还可缓解PrV诱导的BHK-21细胞凋亡，且效果及安全性优于伐昔洛韦。本研究结果为将鬼针草开发成抗病毒中药提供了理论依据。

4 结 论

BPE不能阻断PrV对细胞的吸附，但可抑制和灭活PrV，其抗病毒作用机理是抑制PrVgB基因和蛋白的表达及抑制PrV引起的细胞凋亡。