略阳乌鸡开产日龄遗传参数估计和FSHR基因序列变异与开产日龄的关联性分析

张志远 吕鑫莹 赵家悦 王哲鹏

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

鸡开产日龄是一个与繁殖和生长性能均有密切联系的指标。预估开产日龄的遗传参数，分析卵泡发育调控基因遗传变异与开产日龄的关系，对揭示开产日龄的遗传决定性及性状间的遗传关系，筛选潜在的功能突变，建立适宜育种方案提高地方鸡产蛋性能具有重要意义。

开产日龄(性成熟时间)与产蛋数存在负相关，即开产越早，产蛋数越多。但是，如果在体重不达标的情况下提早开产，将对后期产蛋耐力产生极为不利的影响。为了定量评估遗传效应对鸡开产日龄的决定性，探索开产日龄与产蛋数的遗传关系，前人对开产日龄的遗传参数进行了深入研究。Dana等在埃塞俄比亚地方鸡中估计的开产日龄遗传力最低，为0.06。Savegnago等在白来航鸡中估计的结果最高，为0.54。此外，研究人员对伊朗、坦桑尼亚、泰国、韩国、巴西地方鸡和洛岛红、洛克等培育品种的开产日龄遗传力进行估计，不同品种遗传力估计结果差异较大，平均值为(0.3±0.1)。为阐明开产日龄与产蛋数的关系，为产蛋数间接选择提供依据，研究人员也对二者的遗传关系进行深入研究。Kamali等在伊朗地方鸡中得出开产日龄与开产后12周内产蛋数的遗传相关为-0.85，而Niknafs等在伊朗马赞达兰地方鸡中对同时期产蛋数与开产日龄的遗传相关系数估计后，发现二者的遗传相关系数仅为-0.41。开产日龄与产蛋数的遗传关系不仅在不同品种中得出的结果各不相同，而且在同一品种内二者的遗传关系也会随产蛋期的长短呈现较大的变异。这些结果表明不同品种开产日龄遗传基础存在较大差异，遗传参数难以跨品种应用。

略阳乌鸡是产自陕西省略阳县的地方鸡，该品种具有体型大、蛋肉品质好、营养丰富，对放养适应性强等优点，但也存在产蛋性能差的不足。略阳乌鸡平均开产日龄为147 d，开产到40周龄产蛋数为(54.7±20.4)枚，其产蛋性能远远低于商业蛋鸡品种。略阳乌鸡在产蛋性能方面的不足增大了鸡蛋和鸡苗的生产成本，使乌鸡产品难以以较低的价格走向市场，对乌鸡产业的发展造成了极为不利的影响。因此，估计略阳乌鸡品种特异性遗传参数对略阳乌鸡开产日龄选育具有必要性。

促卵泡素受体(FSHR)是介导FSH信号的受体，在调节卵泡招募、卵泡选择和层级卵泡发育过程中发挥重要作用。研究表明，

FSHR

基因序列变异与鸡开产日龄显著关联，是影响家禽开产日龄的一个重要候选基因。在估计开产日龄遗传参数的基础上，本研究进一步选取

FSHR

基因为对象，分析

FSHR

基因与略阳乌鸡开产日龄的关联性。本研究测定略阳乌鸡开产日龄、开产到30、40和56周龄产蛋数，分析

FSHR

基因内3个错义突变与略阳乌鸡开产日龄的关联性，旨在定量评估遗传效应对开产日龄的决定性及开产日龄与各时期产蛋数间的遗传关系，筛选与开产日龄存在显著关联性的分子标记，为略阳乌鸡开产日龄育种方案的制定和分子辅助育种方法的建立奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 略阳乌鸡的养殖和表型数据采集

略阳乌鸡作为一个地方品种，未受系统选育。该品种维持了较大的表型变异性和遗传多态性，是开展经济性状QTL定位的理想群体。本研究所用样本为略阳乌鸡蛋用系二世代675只母鸡。这些鸡来自46个半同胞家系，295个全同胞家系，为同一批次孵化，在同一栋鸡舍饲养。在56日龄前采用笼养育雏，1～21日龄养殖密度为40只/m，21～56日龄养殖密度为30只/m。育雏温度和光照按标准育雏程序执行。57日龄转入产蛋鸡舍，单笼饲养。开产前采用自然光照，开产后逐步将光照时间延长至16 h，光照强度为20 Lux。全期采用商业全价蛋用雏鸡料、青年鸡浓缩料和产蛋鸡浓缩料(陕西华秦农牧有限公司)饲喂，饲养周期为2018年3月7日—2019年4月8日。养殖工作在陕西龙佳农业科技发展有限公司完成。

将鸡开始产第1枚蛋的时间定义为开产日龄。从17周龄开始，每日记录每只母鸡的开产日龄和产蛋数，直到56周龄。30周龄和40周龄是略阳乌鸡产蛋高峰开始和结束的两个重要时机节点。本研究将开产到30周龄，40周龄和56周龄的产蛋数定义为3个数量性状，分析开产日龄与不同时期产蛋数间的遗传关系。以下四分位数-1.5×四分位距为下限，上四分位数+1.5×四分位距为上限，删除开产日龄、30、40和56周龄产蛋数异常值。

1.2 开产日龄的遗传力及开产日龄与产蛋数间遗传相关估计方法

本研究对675只略阳乌鸡母鸡开产日龄及开产日龄与不同阶段产蛋数的遗传相关进行了估计。开产日龄的遗传力用单变量动物模型

y

=

b

+

a

+

e

进行估计，

y

为开产日龄测定值向量，

X

为性别效应相关设计矩阵，

Z

为育种值效应设计矩阵，

b

、

a

、

e

分别为性别、育种值和残差效应向量。开产日龄与各阶段产蛋数性状间的遗传相关用双变量动物模型进行估计，

y

为性状1和性状2的表型值向量，

X

为固定效应设计矩阵，

Z

为育种值效应设计矩阵，

b

、

a

和

e

分别为性状1和性状2的平均值、育种值和残差向量(

i

=1,2)，运算过程均由R语言MCMCglmm包完成。采用逆伽玛分布指定育种值和残差项方差先验分布。在单变量模型中逆伽马分布的参数为V=1，nu=0.002。在双变量模型中，逆伽马分布的参数为贝叶斯算法迭代次数为130 000，舍弃前30 000次迭代结果，每100次抽取一个参数估计值，获得各参数后验分布。使用posterior.mode命令求得遗传力和遗传相关系数后验分布众数，用HPDinterval命令求得遗传力和遗传相关系数的95 %置信区间。使用Performance Analytics包的chart.Correlation命令计算各性状间的表型相关系数。

1.3 FSHR基因内3个错义突变基因型检测方法

在前期研究中，本研究用RNA-seq技术检测了40周龄略阳乌鸡层级前卵泡转录组(数据未发表)。本研究在

FSHR

基因中发现3个错义突变(表1)，这些突变在略阳乌鸡中处于分离状态。本研究将分析3个错义突变与略阳乌鸡开产日龄的关联性。

翅静脉采血0.5 mL，用ACD抗凝(血液∶ACD=3∶1)后，置于-80 ℃冰箱保存备用。ACD抗凝剂的配方为0.48 g柠檬酸，1.32 g柠檬酸三钠，1.47 g葡萄糖，用双蒸水溶解后定容至100 mL。取20 μL抗凝血，用FlexGen Blood DNA试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)按试剂盒说明提取基因组DNA。

用Sequenom MassARRAY平台检测3个错义突变的基因型，检测样本为675只二世代母鸡。多重PCR反应在384孔PCR板中进行，反应体系由10 ng基因组DNA，0.5 μmol/L正链引物和0.5 μmol/L反链引物，8 mmol/L MgCl，2.5 mmol/L dNTP，1 U热启动酶(NEB)，0.625 μL10×PCR缓冲液和1.75 μL ddHO组成。PCR引物和单碱基延伸反应引物用Sequenom Assay Designer 3.1软件设计，引物序列见表1。PCR反应条件为94 ℃变性5 min，(94 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s)×45个循环，72 ℃延伸3 min。用虾碱性磷酸酶(SAP；NEB)对PCR产物进行去磷酸化处理。反应体系为0.3 μL (1.7 U/μL) SAP，0.17 μL 10×SAP缓冲液，1.53 μL ddHO和5 μL PCR产物。去磷酸化反应条件为37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。对SAP去磷酸化产物执行iPLEX单碱基延伸反应，检测错义突变基因型，iPLEX单碱基延伸引物序列见表1。iPLEX单碱基延伸反应体系由0.2 μL 10×iPLEX buffer, 0.2 μL iPLEX终止子, 0.041 μL iPLEX酶，0.755 μL HO和0.8 μL延伸引物。反应条件为94 ℃变性30 s，(94 ℃变性5 s，(52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s)×5个循环)×40个循环，72 ℃延伸3 min。延伸反应产物用nano-dispenser (Sequenom)点在SpectroCHIP II上，用SpectroAcquire采集数据，用MassArray Typer 4.0软件获取基因分型结果。Sequenom MassARRAY实验由北京康普森生物技术有限公司完成。

表1 基因错义突变信息和基因型检测所用引物
Table 1 gene non-synonymous mutations information and the primers used in genotyping

变异名称①Variation namedbSNP登陆号dbSNP number错义突变Non-synonymousmutations位置LocationMassARRAY引物(5'-3')②Primers of MassARRAY (5'-3')g.8066842C>Trs14317609Thr46IleExon 1ACGTTGGATGACAGTTCTGTGGCATTGGTGACGTTGGATGGTGAAGGCAGGATATTCATCtCGGGGCAGCTGGACCACCTTGg.8124699A>Grs312312510Lys151ArgExon 5ACGTTGGATGGCAAGACATTCATAAGGAGCACGTTGGATGGCCTTAGCTTTTTACCCGTCcAAACTTTCTGGAAGGAGTGCACCg.8142094T>Crs13504817Met335ThrExon 10ACGTTGGATGAGGAAACACAGACGATCTGCACGTTGGATGTCAAATTCGTTCTCCGCAGGATTATATTTCCCATTATGGCA

注：①变异物理位置根据UCSC数据库公布的Galgal 6.0版鸡参考基因给出。②错义突变的基因型用3条引物检测，前2条引物为PCR用引物，第3条引物为单碱基延伸反应用引物。

Note: ① The physical location of the variation is given according to Galgal 6.0 chicken genome assembly in the UCSC database. ② Three primers were used to genotype three non-synonymous variants, of which the first two were used for PCR and the third for single base extension reaction.

1.4 FSHR基因内3个错义突变与开产日龄的关联性检验方法

用单变量线性混合模型

y

=

μ

+

G

β

+

b

分析错义突变基因型与开产日龄的关联性，

y

为个体

i

的开产日龄，

μ

为群体均值，

G

为个体

i

的基因型，

β

为等位基因的加性遗传效应，

b

为随机效应，是方差组分参数，V是一个675×675的亲缘关系矩阵。单变量线性混合模型计算过程用R语言的GMMAT包完成。当

P

<0.05时表示差异显著。

1.5 FSHR基因错义突变保守性分析方法

从Ensembl数据库(http:∥asia.ensembl.org/)下载鸡(ENSGALG00000009100)、火鸡(ENSMGAG00000005711)、鸭(ENSAPLG00000003689)、鹟(ENSFALG00000011021)、斑胸草雀(ENSTGUG00000005697)、人(ENSG00000170820)、猪(ENSSSCG00055018995)、小鼠(ENSMUSG00000032937)、大鼠(ENSRNOG00000016783)、牛(ENSBTAG00000032424)的FSHR蛋白序列，用EMBL-EBI中的Clustal Omega在线多序列比对程序(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)分析鸟类与哺乳动物FSHR蛋白的保守性，用Mview显示分析结果。

2 结果与分析

2.1 开产日龄与产蛋数描述统计

略阳乌鸡蛋用系二世代平均开产日龄为(147.5±7.8) d，其中，75%的鸡会在151日龄前开产(图1)。30周龄平均产蛋数为(28.0±7.6)枚，40周龄平均产蛋数为(58.6±15.0)枚，56周龄平均产蛋数为(75.1±20.4)枚(图1)。略阳乌鸡二世代开产时间相对集中，变异系数为5.4 %，但各阶段产蛋数存在较大群体变异性，变异系数达25.7%～27.1%。

图中每个散点代表一个样本的表型测定结果，背景箱线图标出了各性状的下限(Q1-1.5×(Q3-Q1))、下四分位数(Q1)、中位数、上四分位数(Q3)和上限(Q3+1.5×(Q3-Q1))的位置。 Scattered points represents the phenotypic values of samples. The boxplot shown as background shows the positions of lower inner fence (Q1-1.5×(Q3-Q1)), lower quartile (Q1), median, upper quartile (Q3) and upper inner fence (Q3+1.5×(Q3-Q1)) of each trait.图1 略阳乌鸡开产日龄(a)和产蛋数分布(b)Fig.1 Distribution of age at the onset of egg laying (a) and egg numbers (b) of Lueyang black-boned chicken

2.2 开产日龄遗传力及开产日龄与产蛋数遗传相关分析

略阳乌鸡开产日龄遗传力为0.08，表明该性状受遗传以外因素影响较大(图2)。开产日龄与各时间段内产蛋数存在较强的负遗传相关性，但受环境因素影响，表型相关性较弱，且表型相关性随产蛋时间的延长而减小(表2)。各时间段产蛋数间存在强遗传和表型相关性(表2)。

图中曲线描绘了1 000个后验遗传力概率分布，图上数字为开产日龄后验遗传力众数，括号中的数字给出了后验遗传力95 %置信区间。 The curve shows probability distribution of 1 000 posterior heritabilities. The number on theFigure is the mode of posterior heritabilities. Numbers in the parentheses show 95% confidence interval for the posterior heritability.图2 开产日龄后验遗传力概率分布Fig.2 The posterior heritability probability distribution of age at the onset of egg laying

2.3 鸡FSHR基因错义突变的保守性及其与开产日龄的关联性

为进一步探索略阳乌鸡开产日龄的分子基础，本研究以

FSHR

基因为对象，研究了

FSHR

基因内三个错义突变的保守性，及错义突变与开产日龄的关联性。序列比对结果显示，FSHR第46位氨基酸在各物种中不保守，苏氨酸只在鸡FSHR蛋白中出现，其余物种在该位点均为丝氨酸。鸡FSHR蛋白第151位赖氨酸在所比对的物种中完全保守。第335位氨基酸在各物种中并不保守，有五种氨基酸出现，但该位点氨基酸的疏水性完全保守(图3)。序列比对结果显示，在3个错义突变中有2个错义突变(Lys151Arg和Met335Thr)发生在氨基酸或理化属性较为保守的位点，为进一步阐明这些保守性氨基酸的改变是否关联到表型，本研究进一步检验了3个错义突变与略阳乌鸡开产日龄的关联性。Thr46Ile的C等位基因和Met335Thr的T等位基因对开产日龄具有负的等位基因效应，Lys151Arg的A等位基因显示出正的等位基因效应(表3)。但是，上述等位基因效应均未达到统计显著水平(

P

>0.05)(表3)。

表2 开产日龄与各时间点产蛋数的遗传相关与表型相关分析
Table 2 Genetic and phenotypic correlations analysis between age at the onset of egg laying and egg numbers at three periods

性状1Trait 1性状2Trait 2遗传相关系数Genetic correlationcoefficient①表型相关系数Phenotypic correlationcoefficient②30周龄产蛋数 EN30-0.98 (-0.99, -0.82)-0.59 (<0.001)开产日龄AOE40周龄产蛋数 EN40-0.98 (-1.00, -0.80)-0.37 (<0.001)56周龄产蛋数 EN56-0.98 (-1.00, -0.70)-0.21 (<0.001)30周龄产蛋数EN3040周龄产蛋数 EN400.99 (0.89, 1.00)0.73 (<0.001)56周龄产蛋数 EN560.99 (0.84, 1.00)0.48 (<0.001)40周龄产蛋数EN4056周龄产蛋数 EN561.00 (0.94, 1.00)0.79 (<0.001)

注：①括号中的数字是遗传相关系数95%置信区间。②括号中的数字是表型相关系数显著性检验的值。

Note: ① Numbers in parentheses represent 95% confidence interval of genetic correlation; ② Numbers in parentheses are the values of significance test. AOE=age at the onset of egg laying, EN30-56=egg numbers from age at the onset of egg laying to 30, 40, 56 weeks of age.

3 讨 论

开产日龄作为一个最早能被测定的繁殖性状，揭示它的遗传基础对鸡产蛋性能早期选择具有重要意义。本研究估测了略阳乌鸡开产日龄的遗传力及开产日龄与不同时期产蛋数性状间的遗传相关，并以

FSHR

基因为对象对开产日龄的分子基础进行了初步探索。开产日龄作为一个重要的繁殖性状，之前已有大量研究对其遗传力进行估计，所得结果为0.06～0.54。这表明不同品种开产日龄遗传基础存在较大差异，估计品种特异性遗传力有其必要性。本研究发现略阳乌鸡开产日龄遗传力只有0.08，与埃塞俄比亚Horro鸡(

h

=0.06)、韩国灰褐鸡(

h

=0.12)的遗传力估计结果较为接近，但远远低于选育程度较高的商业品种(

h

=0.24～0.54)。本研究推测商业品种开产日龄遗传力的升高可能与在高强度选择和近交下相关突变的富集与固定有关。

在开产日龄与产蛋数的遗传关系方面，Sang等在韩国地方鸡中获得的遗传相关估计结果在-0.81～-0.5，Kamali等和Niknafs等在伊朗地方鸡中得出遗传相关估计结果与Sang等的估计结果较为接近，为-0.85～-0.41，Tongsiri等在泰国地方鸡中估计的遗传相关系数为-0.73，但Lwelamira等在坦桑尼亚地方鸡中得出结果仅为-0.19～-0.15。上述研究表明，开产日龄与产蛋数的遗传相关关系虽然在相关的强弱程度上不同研究得出的结果存在较大差异，但在相关性质上二者均维持了较为稳定的负遗传相关关系，只有Savegnago等在白来航鸡中得出弱(0.04～0.06)正遗传相关性。在本研究中，这种负遗传相关关系得到证实，支持引起鸡性成熟时间缩短的遗传变异，对鸡产蛋性能也发挥着正面作用。但是，依据开产日龄对产蛋数进行早期间接选择仍需慎重。因为，在表型相关方面，由于受环境因素影响较大，二者相关强度明显低于遗传相关。而且，开产日龄与产蛋数的相关性与产蛋时间的长度也有关系。总的趋势是随产蛋时间延长，相关性逐渐减弱。类似的变化趋势在巴西地方鸡中也曾被报道。这些结果说明依据开产日龄对略阳乌鸡30周龄产蛋数进行早期间接选择有望取得理想选育效果，但对56周龄甚至全期产蛋数进行预测可靠性并不高。鉴于早期产蛋数与后期产蛋数间存在较强遗传和表型相关关系，依据早期(30周龄)产蛋数对后期(40周龄以后)产蛋数做出预测有望取得更理想的选育效果。

FSHR

是调节动物卵泡发育的一个功能基因。之前研究曾发现

FSHR

基因启动子区和内含子变异与家禽开产日龄显著关联，支持

FSHR

是调节家禽性腺发育的一个重要候选基因。本研究分析了3个错义突变的保守性及其与开产日龄的关联性。Lys151Arg和Met335Thr发生在氨基酸或氨基酸理化属性较为保守的位点，暗示这些氨基酸在维持FSHR蛋白的高级结构和功能方面很可能发挥着重要作用。例如，ADAMTS13蛋白的Arg484Lys对其表达和特异性活性有显著影响，发生在

SRY

基因DNA binding domain中的Met21Thr将对人性别决定产生负面影响。但是，关联分析并未检测到Lys151Arg和Met335Thr与略阳乌鸡的开产日龄显著关联。对此，本研究推测有三种可能性：(1)这些错义突变具有功能，但表型效应较小，在现有的样本量和统计模型下难以检出这种表型效应；(2)错义突变对FSH信号的影响可能被其他信号通路补偿，使得这些功能性突变难以表现出表型效应；(3)这些突变并没有影响FSHR的结构和功能。Lys151Arg很可能属于这种情况，因为Lys151Arg虽然发生在一个非常保守的位点，但Lys和Arg均属极性带正电荷氨基酸，相同的理化属性可能决定了这种氨基酸的替换并不具有生物学功能。尽管如此，Thr46Ile和Met335Thr均涉及到氨基酸极性的变化。这种理化属性的改变是否足够改变FSHR的结构和功能，仍需蛋白高级结构预测和试验性研究加以验证。

图中pid下的值表示其他物种FSHR蛋白的氨基酸序列与鸡FSHR蛋白序列的相似性。黑色箭头标出了错义突变Thr46Ile、Lys151Arg和Met335Thr的位置。不同背景颜色代表不同的氨基酸理化性质，其中，绿色表示疏水，蓝色代表带负电荷，红色代表带正电荷、黄色表示半胱氨酸，紫色表示极性氨基酸。最后一行字母和符号标出了该位氨基酸残基理化属性的保守性，大写字母表示保守的氨基酸，“.”表示不保守，“+”表示正电荷，“-”表示负电荷，“a”表示芳香族，“c”表示带电荷，“h”表示疏水性，“l”表示脂肪族，“p”表示极性。 Pid indicates the identity of amino acid residues of FSHR proteins between other species and chicken. The black arrows indicate the locations of non-synonymous mutations of Thr46Ile, Lys151Arg and Met335Thr. Different color backgrounds represent different physical and chemical properties of amino acids, green=hydrophobic, blue=negative charge, red=positive charge, yellow=cysteine, purple=polar. Letters and symbols at the lower line indicates the 100% consistent physical and chemical properties of amino acid residue. Capital letters represent conserved amino acids. “.”=unconserved, “+”=positive charge, “-”=negative charge, “a”=aromatic, “c”=charged, “h”=hydrophobic, “l”=aliphatic, “p”=polar.图3 鸟类与哺乳动物FSHR蛋白的氨基酸序列多重比对分析Fig.3 Multi-alignment analysis of amino acid sequences of FSHR proteins of birds and mammals

表3 基因内3个错义突变与略阳乌鸡开产日龄的关联性
Table 3 Association of three non-synonymous mutations in the gene with age at the onset of egg laying of Lueyang black-boned chicken

名称Name效应等位基因Effect allele开产日龄均值±标准差(基因型频率)Mean±SD of AOE (Genotype frequency)AAABBB等位基因效应值Allele effect valueP值P valueThr46IleC146.92±7.75(0.15)147.45±7.96(0.49)147.66±7.96(0.36)-0.33±0.490.506 2Lys151ArgA146.97±7.58(0.05)147.83±7.96(0.38)147.23±7.96(0.57)0.41±0.580.475 4Met335ThrT147.56±7.97(0.89)145.85±7.60(0.09)149.53±7.56(0.02)-0.018±0.820.981 9

注：AA, AB, BB指每个错义位点的3种基因型。

Note: AA, AB and BB represent three genotypes of each non-synonymous mutation.

4 结 论

本研究发现略阳乌鸡开产日龄遗传力较低，且

FSHR

基因序列变异与开产日龄不存在关联性，表明遗传效应对开产日龄的调控作用较小。但是，开产日龄与产蛋数存在较强负遗传相关性。这些结果建议，对略阳乌鸡开产日龄而言，饲养管理是更为有效的调控手段。依据开产日龄对产蛋数进行早期间接选择具有可行性，但间接选择的准确性会随产蛋期的延长而降低。