响应面法优化杂豆酸豆乳发酵工艺及体外消化分析

吕铭守，高亦昕，石彦国，刘琳琳，孙冰玉，朱秀清

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高校食品科学与工程重点实验室/黑龙江省谷物食品与谷物资源综合加工重点实验室，黑龙江哈尔滨 150028）

发酵杂豆酸豆乳是将多种豆类磨浆后接种乳酸菌制得的植物基发酵饮品，具有风味独特、营养丰富、可缓解乳糖不耐症的特点。随着全球膳食结构的改善，人们对豆基酸奶的关注越来越多，有研究表明[1]利用双歧杆菌发酵豆乳可以降低豆类中寡糖含量，更利于消化，并且其产品作为优质的植物蛋白来源有很好的发展前景，提供了一种较好的替代乳制品蛋白方法。

发酵酸豆乳含有丰富的营养价值，提升口感风味的同时又具有较强的自由基清除能力[2−3]，提高抗氧化性。Lee等[4]利用植物乳杆菌发酵豆浆，结果表明豆浆发酵后羟基自由基清除率提高了0.28倍。李彤等[5]研制黄豆、花生、红豆、绿豆复合发酵饮料，其反式-2-壬烯醛、癸醛含量有所增加，极大丰富了饮料的香气。Fernandes等[6]考察了贮藏开菲尔发酵豆乳模拟体外消化后异黄酮和总酚含量变化，结果显示经消化后苷元异黄酮含量和总酚含量都有明显的上升，证明豆乳经发酵可使活性物质含量增多，提高营养价值的利用[7]，同时丰富其口味，具有广阔的研发前景。

目前市场上出现的发酵植物基饮品中多以黄豆为原料制备酸豆乳，一定程度上限制了酸豆乳的风味及营养。以混合豆类为原料制备酸豆乳，并研究其抗氧化能力和功能活性物质变化较少。因此，本研究以黄豆、黑豆、红豆为原料，利用单因素及响应面法优化杂豆酸豆乳发酵工艺制备发酵酸豆乳，分析了杂豆酸豆乳发酵前后经模拟胃肠消化后总酚、总黄酮以及DPPH、ABTS、羟基自由基清除率、还原力的变化规律，以期获得高营养价值的杂豆酸豆乳，为提升其益生功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄豆、红豆、黑豆 哈高科食品有限公司；发酵剂 法国丹尼斯克；白砂糖 市售；谷氨酰胺转氨酶（TG酶） 山东天奉生物工程公司；水杨酸、福林酚、铁氰化钾等化学试剂 分析纯，辽宁试剂有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 分析纯，北京索莱宝科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 分析纯，国药集团。

磨浆机 凯润食品机械厂；DHP-9162型恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；BCD-430W冰箱 青岛海尔有限公司；AlpHa-1506型紫外分光光度计上海谱元仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵工艺 取适量颗粒饱满，品质良好红豆、黑豆和黄豆，豆水体积比1:3浸泡12 h，豆水比1:8磨浆，100目滤布过滤，煮沸，加入食品级白砂糖，搅拌，95 ℃灭菌15 min，冷却至室温，无菌条件下加入TG酶、直投式发酵剂接种，37 °C恒温发酵，4 ℃冷藏后熟12 h。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 杂豆比对杂豆酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响 以杂豆（红豆：黑豆：黄豆）质量比为1:1:1、1:1:2、1:2:1、2:1:1、2:1:2的比例磨浆，蔗糖添加量为8%，TG酶添加量为0.6 g/L，发酵时间为11 h进行发酵，考察不同杂豆比对杂豆酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响。

1.2.2.2 蔗糖添加量对杂豆酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响 以杂豆（红豆:黑豆:黄豆）质量比为1:2:1比例磨浆，设置蔗糖添加量为2%、4%、6%、8%、10%，TG酶添加量为0.6 g/L，发酵时间为11 h进行发酵，考察不同蔗糖添加量对杂豆酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响。

1.2.2.3 TG酶添加量对杂豆酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响 以杂豆（红豆：黑豆：黄豆）质量比为1:2:1比例磨浆，蔗糖添加量为8%，设置TG酶添加量为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L，发酵时间为11 h进行发酵，考察不同TG酶添加量对杂豆酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响。

1.2.2.4 发酵时间对杂豆酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响 以杂豆（红豆:黑豆:黄豆）质量比为1:2:1比例磨浆，蔗糖添加量为8%，TG酶添加量为0.6 g/L，设置发酵时间为7、9、11、13、15 h，进行发酵，考察发酵时间对杂豆酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响。

1.2.3 响应面优化试验 蔗糖添加量（A）、TG酶添加量（B）、发酵时间（C）为因素，感官评分为响应值，进行响应面优化实验，响应面试验因素水平表见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.4 模拟体外消化实验 模拟胃液消化：参考Morell等[8]方法，取20 g酸豆乳，用1 mol/L HCl溶液调节样品pH至2.0，加入模拟消化胃液（0.32 g的胃蛋白酶溶解0.1 mol/L HCl溶液），在37 ℃条件下，150 r/min恒温水浴振荡2 h，消化2 h后取样，用1 mol/L NaOH溶液将样品pH迅速调节至7.0，灭酶，离心，取上清液。

模拟肠液消化：取胃液消化后样品10 g，调节pH至7.8，加入模拟消化肠液（0.29 g的胰蛋白酶溶解pH7.0的磷酸盐缓冲液），在37 ℃条件下，150 r/min恒温水浴振荡2 h，消化2 h后取样，将样品pH迅速调节至7.0，灭酶，离心，取上清液。

1.2.5 指标测定

1.2.5.1 滴定酸度的测定 参考GB 5009. 239-2016方法[9]进行测定，100 mL样品所消耗0. 1 mol/L的标准NaOH的体积，记为酸度°T。

1.2.5.2 感官评价 选20名感官评价小组成员，评价不同单因素方法制作的酸豆乳色泽、香气、风味、组织状态[10]，评定标准详见表2。

表2 酸豆乳感官评价表Table 2 Sensory evaluation of fermented mixed-bean milk

1.2.5.3 总酚含量的测定 参考文献[11]方法，标准曲线测定：将0.025 g没食子酸定容100 mL，取0.1～0.5 mL等梯度该溶液，加入10% 福林酚2.5 mL，0.7 mol/L Na2CO3溶液2 mL，定容至10 mL，50 ℃水浴10 min，765 nm测其吸光度；样品测定：取1 mL样液，按以上步骤，重复试验3次。

1.2.5.4 总黄酮含量的测定 参考文献[11]方法，标准曲线测定：80% 乙醇溶解0.04 g芦丁并定容至100 mL。取0.6～3.0 mL等梯度芦丁溶液，加入0.4 mL Al(NO3)3静置6 min ，加入0.4 mL NaNO2、4 mL NaOH溶液，80%乙醇定容至10 mL，510 nm波长下测其吸光度；样品测定：取1 mL样液，按以上步骤，重复试验3次。

1.2.5.5 DPPH自由基清除率的测定 参考Lee等[12]方法略有改动，样液4 mL加入等体积0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，避光反应，517 nm波长下测其吸光度，重复试验3次，计算公式为：

式中：A0为等体积DPPH乙醇溶液加乙醇溶液的吸光值； A1为等体积DPPH乙醇溶液加样品的吸光值；A2为等体积乙醇溶液加样品的吸光值。

1.2.5.6 ABTS+自由基清除率的测定 参考Lee等[12]方法略有改动，等体积混合7 mmol/L ABTS溶液与2.5 mmol/L过硫酸钾溶液，避光反应15 h，使用前用pH7.4的PBS溶液稀释至吸光度0.700±0.005。0.2 mL样品与7.8 mL ABTS溶液混合，避光反应，734 nm波长测吸光度，重复试验3次，计算公式为：

式中：A3为空白组吸光值；A4为样品的吸光值。

1.2.5.7 羟基自由基清除率的测定 参考Xu等[13]方法略有改动，4 mL样品加入等体积 6 mmol/L硫酸亚铁和 6 mmol/L过氧化氢溶液，静止5 min后加4 mL 6 mmol/L水杨酸，37 ℃水浴30 min，510 nm波长测吸光度，重复试验3次，计算公式为：

式中：A5为样品溶液吸光值；A6为蒸馏水换为水杨酸吸光值；A7为空白组吸光值。

1.2.5.8 还原力的测定 参考Xu等[13]方法略有改动，2 mL样品加入5 mL等体积 pH 6.6 PBS溶液、铁氰化钾混合溶液，50 ℃水浴20 min，加5 mL 10%的三氯乙酸溶液，静置10 min，取5 mL上清液与5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%三氯化铁反应，700 nm波长测吸光度，重复试验3次。

1.3 数据处理

每组数据平行3次取平均值，利用SPSS 20.0分析数据显著性，利用Design-Expert12进行响应面分析，利用Origin 2018进行作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 杂豆比对酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响

如图1所示，感官评分和滴定酸度呈现先上升后下降的趋势，当红豆:黑豆:黄豆比为1:2:1时感官评分最高，为78.2分，滴定酸度为73.6 °T，由于不同豆子营养成分和口感略有不同，当红豆比例高时，酸豆乳颜色微红；当黑豆比例高时，酸豆乳颜色微深，而杂豆比为1:2:1时，杂豆酸豆乳口感醇厚，酸豆乳整体颜色、组织状态较佳，因此最佳杂豆比为1:2:1。

图1 杂豆比对酸豆乳的影响Fig.1 Effect of mixed bean ratio on fermented mixed-bean milk

2.1.2 蔗糖添加量对酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响 如图2所示，蔗糖添加量增加时，感官评分先升高后降低，添加量为8%时，感官评分达到最大值，为78分，滴定酸度76.6 °T，滴定酸度随着蔗糖含量的增高持续上升，原因是在发酵过程中蔗糖不仅作为碳源被利用，蔗糖的加入还会加速乳酸菌生长，乳酸增多，滴定酸度上升。当添加量少时，体系不利于微生物生长，使得产酸量过少[14]，风味不佳；若添加量过多，整体酸甜风味失调，口感甜腻，因此最佳蔗糖添加量为8%。

图2 蔗糖添加量对酸豆乳的影响Fig.2 Effect of sucrose addition on fermented mixed-bean milk

2.1.3 TG酶添加量对酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响 如图3所示，随着TG酶添加量提高，滴定酸度逐渐增加，感官评分先上升后降低，最高的感官评分为78.6分，此时TG酶添加量为0.6 g/L，滴定酸度为74.3°T，在此条件下的杂豆酸豆乳的组织更加稳定，粘稠性好，无乳清析出。酸豆乳中添加TG酶是为了使得酸豆乳凝胶体系稳定、丰富口感。有研究表明[15]，发酵过程中添加TG酶，促进体系中的蛋白质交联，将游离水锁在蛋白质的凝胶网络结构中[16]，所以TG酶添加量低时样品的凝乳结构不佳，当添加量过多时，口感略粗糙，导致感官评分较低，因此最佳TG添加量为0.6 g/L。

图3 TG酶添加量对酸豆乳的影响Fig.3 Effect of TG enzyme addition on fermented mixed-bean milk

2.1.4 发酵时间对酸豆乳感官评分和滴定酸度的影响 如图4所示，当发酵时间延长，滴定酸度上升，感官评分先上升后下降，11 h时评分为81.5分达到最高，之后样品口感变酸、凝乳不佳。发酵时间与杂豆酸豆乳的风味品质密切相关，发酵时间过短，微生物还处于生长繁殖的状态，体系难以形成凝乳，豆腥味较重、风味欠佳；发酵时间过长会使得体系中混入杂质，导致体系中微生物大量繁殖，引起滴定酸度的增加，造成代谢产物积累进而产生不良风味[17]，此外过度的发酵，导致蛋白质结构松散，使得酸豆乳内聚性降低[18]，出现析水的现象。因此最佳发酵时间为11 h。

图4 发酵时间对酸豆乳的影响Fig.4 Effect of fermentation time on fermented mixed-bean milk

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果 基于单因素实验结果，感官评分与滴定酸度并不始终呈现正相关，所以滴定酸度不作为响应面实验因变量。设计响应面优化实验，蔗糖添加量（A）、发酵时间（B）、TG酶添加量（C）为因变量，感官评分（Y）为自变量，设计及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiment

利用统计分析，得到回归方程：

方差分析见表4，总模型方程呈极其显著（P<0.0001），决定系数R2=0.9896，校正决定系数R2Adj=0.9762，可预测97.6%响应值，失拟项（P>0.05）不显著，一次项、二次项影响均显著，交互项AB显著，其余不显著。据F值得，因素贡献率为：A>B>C。

表4 回归模型方差分析Table 4 ANOVA analysis for the response variables

2.2.2 响应曲面图结果 如图5所示，蔗糖添加量与TG酶添加量曲面趋于较陡，对感官评分有影响。得出发酵理论最优条件为：蔗糖添加量7.195%，TG酶添加量0.625 g/L，发酵时间10.078 h，理论感官评分为87.796分。为方便验证试验将条件优化为：蔗糖添加量7.2%，TG酶添加量0.63 g/L，发酵时间10 h。按照该方法平行三次发酵实验制备杂豆酸豆乳的感官评分为（88.1± 0.28）分，与理论值误差为0.72%，证明该发酵工艺可靠。

图5 交互作用对杂豆酸豆乳感官得分影响的响应面图Fig.5 Response surface map of the effects of interactions on sensory score of fermented mixed-bean milk

2.3 体外消化过程中杂豆酸豆乳总酚、总黄酮含量的变化

没食子酸标准曲线：y=1.274x+0.0415，R2=0.9963；芦丁标准曲线：y=16.85x+0.0212，R2=0.9929。由表5所示，未消化时，杂豆乳与杂豆酸豆乳的总酚含量分别为1.84、2.92 mg/mL，模拟胃液、肠液处理后，发酵组的总酚含量较未消化提升了25%、51%。在胃液消化阶段，胃酸环境加快了酚类物质的释放，消化后的样品酶活性也有所提升，使得酚类化合物被水解，同时消化道中的酶可与蛋白质和碳水化合物等高分子量化合物反应，并释放与这些化合物结合的酚类物质，显著增加了消化过程总酚类物质的浓度[19]。酚类等抗氧化活性物质在此过程中可能降解为小分子酚类物质，使具有供氢体活性的酚羟基数目增加，在氧化过程中，酚羟基参与多种自由基反应，阻断自由基链的反应[20]。结果与Dai 等[21]及Rodriguez-Roque等[22]研究结果相似。

由表5所示，未消化时，杂豆乳与杂豆酸豆乳的总黄酮含量分别为0.88、1.86 mg/mL，模拟胃液、肠液处理后，发酵组的总黄酮含量较未消化提升了61%、22%。未发酵组与发酵组在肠液消化后的总黄酮含量较胃液消化后的含量分别降低了12.1%、24.4%，但仍高于未消化时总黄酮的含量，该结果表明酸性条件下可以提高黄酮类物质的释放，导致该现象的原因是因为此时的样品从胃液环境中转变为弱碱性的肠液中，样品中的黄酮类物质在碱性环境中不稳定，易被降解为酚醛类化合物[23]。Sanjukta等[24]研究表明模拟胃液消化下发酵后总黄酮含量显著增加了22%，变化趋势与本实验一致。

表5 胃液、肠液消化对杂豆酸豆乳总酚、总黄酮以及抗氧化能力的影响Table 5 Effects of gastric juice and intestinal juice digestion on total phenols, total flavonoid and antioxidant capacity of fermented mixed-bean milk

2.4 体外消化下杂豆酸豆乳抗氧化能力的变化

研究表明[22]，豆乳中富含亲水性和亲脂性抗氧化剂，通过考察酸豆乳体系对特定自由基的清除能力、稳定性与金属离子的螯合能力来评价其抗氧化特性。通过选取具有稳定性最好的DPPH自由基清除率、特异选择性的ABTS自由基清除率、非特异性选择性的羟基自由基清除率以及还原力进行测定。

DPPH自由基在避光条件下具有极强的稳定性，其接受质子和电子形成稳定的分子结构。由表5可知，未消化时，杂豆乳与杂豆酸豆乳的DPPH自由基清除率分别为37.36%、47.71%。胃液消化后未发酵组和发酵组的DPPH自由基清除率较未消化时分别提高了2.8%、14.9%，随着胃液到肠液消化，发酵组和未发酵组的DPPH自由基清除率均升高，该结果表明杂豆酸豆乳在胃液、肠液消化的环境中暴露出较多供氢基团与自由基结合[25−26]，形成稳定的分子结构。

ABTS自由基较稳定，可与抗氧化成分发生反应而使体系褪色。未消化时，杂豆乳与杂豆酸豆乳的ABTS+自由基清除能力分别为15.64%、20.53%。胃液消化后未发酵组和发酵组的ABTS+自由基清除能力略有上升，肠液消化后发酵组和未发酵组的ABTS+自由基清除能力较未消化时分别上升了0.4、0.48倍，该结果表明胃蛋白酶处理破坏了杂豆酸豆乳中的空间结构，有利于ABTS+自由基的结合和捕获，导致螯合能力增强[27−28]，也可能是具有抗氧化性的物质在胃肠液消化过程中，结构形态发生变化，导致其作用位点改变，进而影响抗氧化能力[29]。

羟自由基具有非特异选择性，其是对细胞造成损伤的最活跃的一种活性氧。未消化时，杂豆乳与杂豆酸豆乳的羟基自由基清除率分别为34.32%、41.45%。胃液消化后未发酵组和发酵组的羟基自由基清除率较未消化时分别提高了36.3%、26.0%，肠液消化后发酵组和未发酵组的羟基自由基清除率均升高，该结果可能是因为杂豆酸豆乳中活性物质与胃蛋白酶、胰蛋白酶相互作用，导致羟基自由基清除率提高[30]。

还原力可表明样品中蛋白质与金属离子的螯合能力的强弱，未消化时，杂豆乳与杂豆酸豆乳的还原能力的吸光值分别为0.14、0.22。在胃液消化阶段，发酵组还原能力的吸光值从0.22上升至0.31，此时还原力吸光度最大，肠液消化后的还原能力的吸光值为0.28，较胃液消化降低了0.1倍，但仍高于未消化样品，该结果表明发酸豆乳在胃液消化后可以形成更多有效的氢或电子供体，此时体系呈较酸的环境，体系中的大部分酶类物质此阶段被破坏，当进行肠液消化时，环境中pH逐渐上升，螯合能力减弱[31]，可能是具有抗氧化性的肽段被水解进而破坏了抗氧化性的氨基酸序列结构，导致生物活性更低[32]。

2.5 体外消化过程中总酚、总黄酮含量与抗氧化能力相关性分析

如表6所示，总酚与DPPH、ABTS+自由基清除率的相关系数为0.987、0.949，呈极显著正相关（P<0.01）；与羟基自由基清除率的相关系数为0.889，呈显著正相关（P<0.05）；与还原力不相关。总黄酮与还原力的相关系数为0.881，呈显著正相关；与其余指标不相关。原因可能总酚、总黄酮以及其他活性成分共同影响着抗氧化活性的变化，例如微生物发酵产生的多糖、蛋白质等，存在于细胞质中的营养物质，均可影响抗氧化活性[33]。Hussein等[34]等研究报道称总酚含量增加，进而增加了抗氧化活性，由于酚类化合物可以作为氢供体、还原剂从而减少产物的氧化。Stratil等[35]得出DPPH自由基清除率与多酚相关性显著，与该分析相似。

表6 体外消化过程中总酚、总黄酮含量与抗氧化能力相关性分析Table 6 Correlation analysis of total phenols, total flavonoid contents and antioxidant capacity during in vitro digestion

3 结论

据单因素和响应面试验结果，感官得分为指标，杂豆酸豆乳发酵最佳工艺为：蔗糖添加量7.2%，TG酶添加量0.63 g/L，发酵时间10 h，在此工艺条件下，感官得分为88.1分。分析胃肠液消化的杂豆酸豆乳中总酚、总黄酮含量和抗氧化性，结果表明：经模拟体外消化，杂豆酸豆乳的总酚含量逐步增大，与未消化相比，胃液、肠液消化后分别提高了25%、51%；总黄酮含量在胃液、肠液消化分别中提升了0.4、0.22倍；消化后的杂豆酸豆乳DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羟基自由基清除率随着消化的进行逐渐上升，还原力与胃液消化相比，肠液消化降低了0.1倍，但仍高于未消化样品。胃肠消化下总酚与DPPH、ABTS+、羟基自由基清除率呈正相关（P<0.05）；总黄酮与还原力正相关（P<0.05）。进一步说明经消化后杂豆酸豆乳的总酚、总黄酮含量增加，抗氧化能力增强，为杂豆酸豆乳的开发提供理论依据和参考。