鸡骨液酶解工艺优化及其酶解前后风味物质分析

李泽林，王秋婷，郭其洪，桂海佳，谷大海，王雪峰，肖智超，王桂瑛，范江平

（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201）

我国是鸡肉等禽肉生产大国，2020年肉鸡总产量约为1485万吨，是四大肉鸡主产国之一，肉鸡在加工过程中会产生大量副产品，其中鸡骨就是主要副产物之一[1]。鸡骨中含有丰富的蛋白质（含量可达16.3%与等量鸡肉相似）、脂肪、矿物质、氨基酸、软骨素、酸性黏多糖和维生素等多种营养素，比例均衡、生物价高，是优质的蛋白源[2−3]；目前，有少部分鸡骨被制作成鸡骨泥或粉添加到食品中，有部分被用来制作明胶、提取鸡骨素和蛋白水解物等[4]；鸡骨被水解后会释放大量的呈味游离氨基酸，还会产生和谐的香气，具有良好的制作调味料基料的潜质；但是，鲜有文献报道鸡骨酶解前后关键的风味化合物，因此探明鸡骨关键呈味游离氨基酸和关键香气化合物有助于推动以鸡骨为基料的食品风味机制的探究。

味觉活性值[5]（taste activity value，TAV）和香气活性值[6]（odor activity value，OAV）是评价食品中化合物对滋味和香气贡献大小的重要量化指标；前者可以评价化合物，如游离氨基酸对食品酸、甜、苦、咸、鲜滋味的贡献度，后者则可以评估挥发性化合对食品香气轮廓的贡献[7]。目前，TAV和OAV已被广泛应用到食品领域，用来评估分析食品成分对滋气味的影响。张曼等[8]结合TAV和OAV筛选发现不同产地的鲜辣椒没有特征凸出的呈味氨基酸，有17种关键香气成分（OAV>1），其中2-甲氧基-3-异丁基吡嗪、乙酸己酯、α-合金欢烯是构成鲊辣椒风味的关键物质。孙圳等[9]在卤制鸡肉中发现正辛醛、反-2-癸烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和芳樟醇OAV>1，并确定这些化合物为卤制鸡肉的关键香气物质。

因此，为了探究鸡骨液酶解前后游离氨基酸及挥发性香气成分的变化情况，本研究拟展开鸡骨液酶解工艺优化研究，并分析酶解前后的游离氨基酸及挥发性成分，以筛选出对其滋味和香气有关键贡献的游离氨基酸和挥发性香气化合物。旨在为鸡骨的综合利用以及其风味的深入研究提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白羽肉鸡全骨（干净剔除鸡身所有肉、油、皮和筋） 云南农业大学实验鸡场提供；动物蛋白水解酶（食品级，4万U/g）、风味蛋白酶（食品级，5万U/g） 浙江一诺生物科技有限公司；C7～C30正构烷烃标准品、3-辛醇标准品 美国Sigma公司；硫酸 天津市风船化学试剂科技有限公司。

PL303型分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；PHS-3C型雷磁pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；S-433型氨基酸自动分析仪 德国sykam公司；SCION SQ 456-GC型气质联用仪 美国力可有限公司；DB-WAX型色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 安捷伦科技（中国）有限公司；PG-150型碎骨机 诸城市广优机械科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鸡骨液酶解工艺 取鸡骨→碎骨机破碎（过60目筛）→加水混匀→调节pH→加入酶→水浴酶解→灭酶→离心→取上清液备用。

操作要点：鸡骨匀浆液先调整pH到7使其达到动物蛋白酶与风味酶最适値，再加入酶（两者比例1:1，w/w）；待酶解完成后，酶解液沸水浴灭酶10 min；最后在4000 r/min条件下离心15 min。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 酶解时间对样品水解度的影响 以水解度为指标，固定料液比1:3 g/mL、酶解温度50 ℃、复合酶添加量0.5%，探讨不同酶解时间（3、4、5、6 h）下样品水解度的大小。

1.2.2.2 酶解温度对样品水解度的影响 以水解度为指标，固定酶解时间5 h、料液比1:3 g/mL、复合酶添加量0.5%，探讨不同酶解温度（45、50、55、60 ℃）下样品水解度的大小。

1.2.2.3 料液比对样品水解度的影响 以水解度为指标，固定酶解时间5 h、酶解温度50 ℃、复合酶添加量0.5%，探讨不同料液比（1:2、1:3、1:4、1:5 g/mL）下样品水解度的大小。

1.2.2.4 酶添加量对样品水解度的影响 以水解度为指标，固定酶解时间5 h、酶解温度50 ℃、料液比1:3 g/mL，探讨不同复合酶添加量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）下样品水解度的大小。

1.2.3 响应面试验 根据单因素实验结果，固定酶解温度50 ℃进行三因素三水平响应面试验设计，因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Factor level design of response surface test

1.2.4 水解度测定 氨基酸态氮的测定：根据GB 5009.235《食品中氨基酸态氮的测定》的方法进行测定；总氮的测定：根据GB 5009.5《食品中蛋白质的测定》的方法进行测定。按照公式（1）计算水解度：

1.2.5 游离氨基酸测定 取酶解前后的鸡骨液进行游离氨基酸的测定：根据GB 5009.124《食品中氨基酸的测定》的方法使用氨基酸自动分析仪进行检测。

1.2.6 味觉活性值计算 参考Zhang等[10]的方法，利用味觉活性值（taste activity value，TAV）评价各呈味氨基酸对鸡骨液滋味的影响。按以下公式（2）计算TAV：

1.2.7 挥发性成分的GC-MS检测 样品处理：取酶解前后鸡骨液样品6 mL于顶空瓶（20 mL）中，插入萃取头萃取30 min（60 ℃）后取出，再插入气相色谱进样口解吸3 min（250 ℃）。GC条件：色谱柱：DBWAX石英毛细柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱流量：恒流的模式进样（0.8 mL/min）；载气：高纯度氦气；起始温度40 ℃（3 min），第一阶段5 ℃/min升至90 ℃，第二阶段10 ℃/min升至250 ℃（6 min）；进样口的温度为250 ℃。MS条件：离子源：EI；离子源温度200 ℃；电压70 eV；色谱-质谱接口温度250 ℃。

挥发性化合物定性：将质谱数据与相应标准进行比对，并与NIST 14的数据进行比较。保留指数（RI）的计算方法如下：以标准品保留时间和相同色谱条件下C7～C30正构烷烃的保留时间计算检测物质的保留指数（RI）。定量：对挥发性化合物定量时添加3-辛醇为内标物，以内标物的峰面积与气味活性化合物的峰面积比值计算各物质的含量。

1.2.8 香气活性值计算 参考Yang等[11]的方法，利用香气活性值（odor activity value，OAV）评价各挥发性化合物对鸡骨液酶解前后香气轮廓的影响。按以下公式（3）计算OAV：

1.3 数据处理

试验均重复三次取平均数，使用设计专家设计响应面试验，Excel 2016制作雷达图及数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酶解温度对水解度的影响 由图1a可知，当酶解温度在45～50 ℃时，水解度随着温度升高而增加，当温度为50 ℃时，水解度最大32.46%±0.68%。当酶解温度高于50 ℃时水解度随着温度的升高而下降，原因是温度过高引起蛋白质分子过度聚合，酶的活力受到影响，酶蛋白变性，水解度随之降低。因此，50 ℃为最优酶解温度。

图1 单因素实验结果Fig.1 Single factor test results

2.1.2 酶解时间对水解度的影响 由图1b可知，酶解3～5 h时水解度逐渐增大，酶解5 h时水解度最高33.79%±0.84%，酶解时间继续增加化学反应平衡后，反应向反方向进行，水解度降低。因此，5 h为最优酶解时间。

2.1.3 酶添加量对水解度的影响 由图1c可知，随着酶添加量的增加、酶活增大，水解度增高，当酶添加量为0.6%时，水解度最大33.72%±0.48%，当超过0.6%时水解度下降。因此，酶添加量0.6%为最优值。

2.1.4 料液比对水解度的影响 由图1d可知，随着料液比的减小，鸡骨的水解度呈先增大后减小的趋势，在料液比为1:3 g/mL时，鸡骨的水解度最大为32.7%±1.07%。料液比决定了酶解底物的浓度，在1:2 g/mL时因底物的浓度过高，影响了反应的化学平衡导致水解度低；当料液比超过1:3 g/mL时，反应底物的浓度过低，化学反应变慢，导致水解度下降。因此，1:3 g/mL为最佳料液比。

2.2 响应面试验结果

根据单因素的实验结果，在温度50 ℃、复合酶比例1:1条件下，通过响应面试验设计，对酶解鸡骨液工艺进一步优化。结果如表2所示。

表2 响应面设计及结果Table 2 Response surface design and results

对表2数据进行回归分析，结果得到二次多项回归方程为：Y=33.15+1.68A+1.23B+1.59C−1.92AB−2.07AC−0.90BC−2.08A2−2.38B2−1.39C2

根据表3，对回归模型方差进行分析。模型P<0.01，失拟项P=0.2940>0.05，说明模型显著具有可行性。模型的决定系数R2=0.9604，R2Adj=0.9094，两者相差较小，说明此模型可用于分析酶解鸡骨的工艺优化。模型中，一次项A、B、C，交互项AB和AC，二次项A2、B2对水解度的影响极显著（P<0.01），根据F值可以得出因素对水解度的影响顺序依次为酶解时间>料液比>酶添加量。

表3 回归模型方差分析及模型显著性检验Table 3 Regression model analysis of variance and model significance test

2.3 交互作用分析及模型验证

响应曲面图与等高线图可以反映两个变量之间的交互类型以及各因素对水解度影响的显著性。由图2a～c可知，随着因素的增大，水解度先增大后下降，这与单因素实验结果相一致。图2a～b的等高线图属于椭圆形，说明交互作用显著，而图2c的等高线图接近圆形，说明交互作用不显著，这与方差分析表中的结果相一致。

图2 各因素交互作用响应曲面及等高线图Fig.2 Response surface and contour plot of interaction of various factors

通过模型得到的最优结果为：时间5.1 h、酶添加量0.61%、料液比1:3 g/mL，水解度为33.68%±1.53%。根据此工艺条件进行3组重复试验，并计算其水解度的平均值为33.24%±0.61%，与理论值相比无显著性差异（P＞0.05），说明该工艺具有可行性。

2.4 酶解对鸡骨液游离氨基酸含量及味觉活性值的影响

鸡骨中的蛋白质有90%以上属于结构性的胶原蛋白、呈纤维状，其含量占机体总蛋白的25%～30%[12]，这些蛋白被酶解后可添加到风味基料和调味料中以增强其风味的丰富度及层次感。由表4可知，鸡骨酶解前游离氨基酸含量较低，呈甜味的氨基酸总含量最高仅为535.37 mg/kg，酶解后17种游离氨基酸含量均极显著（P<0.01）增加，以苦味氨基酸增幅最大总含量达到了9776.58 mg/kg，相比酶解前增加了27.9倍，与丁小燕等[13]研究的双酶水解鸡骨泥结果一致。虽然苦味氨基酸在酶解后极显著（P<0.01）增加，但苦味氨基酸不具备味觉活性，且其苦味易被其他呈味氨基酸的味道掩盖[14]。此外，呈甜味的精氨酸与呈鲜味的谷氨酸协同作用下可以呈现令人愉快的味道，也可以掩盖大部分苦味。所以，鸡骨酶解液滋味主要以鲜味和甜味为主。

表4 鸡骨液酶解前后游离氨基酸含量、阈值、呈味特性及TAV值Table 4 Contents, thresholds in water, taste contribution and TVA value of free amino acids in chicken bone homogenate before and after enzymolysis

当TAV值大于1时，认为该物质具有强烈的滋味活性，对食物的整体滋味轮廓贡献大，且TAV的大小和其对滋味贡献成正比[15]。本研究酶解前游离氨基酸的TAV只有谷氨酸（8.76）、丙氨酸（2.65）、缬氨酸（1.43）和赖氨酸（5.56）大于1，酶解后所有检测到的游离氨基酸TAV均大于1。其中，天门冬氨酸（13.85）、谷氨酸（78.92）、丙氨酸（24.60）、缬氨酸（41.09）、蛋氨酸（32.30）、异亮氨酸（16.52）、亮氨酸（13.97）和赖氨酸（81.99）的TAV均大于10远大于1，对其整体风味贡献极强。

2.5 酶解前后鸡骨液挥发性风味物质的变化

续表 4

续表 5

续表 5

采用HS-SPME-GC-MS对酶解前后的鸡骨液检测，结果如表5所示，共检测出挥发性化合物92种，酶解前63种，酶解后66种，其中包含了27个醇、10个酮、9个酸、7个酯、15个烃类、1个酚、3个杂环和20个醛类。这些化合物构成了鸡骨酶解前后的挥发性风味轮廓，醇和酸类相对含量在酶解后增加，醛类、烃类和酮类减少，说明这些化合物含量的变化使酶解前后鸡骨液挥发性组成成分以及其对香气的贡献有所差别。

表5 鸡骨液酶解前后挥发性成分比较Table 5 Comparison of volatile components of chicken bone homogenate before and after enzymatic hydrolysis

醇和酸主要是赋予食物芳香、花香、甜味、水果味、酸味和蘑菇味的主要来源，酸可以由氨基酸降解后经氧化或还原作用产生，也可能由饱和脂肪酸本身氧化降解产生，是酯类化合物合成的前体物质[16−18]。本研究中，酶解后辛醇、1,2-庚二醇、芳樟醇、薄荷醇和庚酸、壬酸、戊酸等对花香、香甜、酸香和水果香有贡献的化合物含量增加。烃类化合物可能是由脂质自氧化产生，且大部分烃类物质被报道香气较弱或无气味[19]；醛类也可以由食物中脂肪酸的氧化和蛋白质的Strecker降解反应而生成且气味阈值较低[20]，与酮类等挥发性化合物具有麦芽味、青草味、甜味、烤面包香、焦糖香和咖啡香等[21−22]。本研究中，1-辛烯-3-酮、5-甲基-3-庚酮、甲基庚烯酮和正戊醛、己醛、壬醛、苯甲醛等在酶解后消失或者含量降低会造成香气的减弱，但反式-2-癸烯醛、十四醛、庚醛和十六醛等的增加会减少青草味等不愉快的气味。此外，酶解后2-戊基呋喃、2-乙基呋喃和2-正丁基呋喃含量的增加会增强鸡骨液的烤香味。

2.6 鸡骨液关键挥发性香气成分及其香气轮廓分析

OAV是将GC-MS所测定的挥发性化合物浓度与每种挥发性化合物对应的嗅觉阈值相结合分析，可有效地评估每一个挥发性成分对样品香气轮廓的贡献大小[23]。化合物的OAV大于或等于1说明该挥发性成分能被感官察觉且对鸡骨的整体香气贡献较大。

由表6可知，鸡骨液酶解前后OAV≥1的风味物质共有17种，其中酶解前13种、酶解后16种，包括醇类4种、酯类2种、呋喃类2种、醛类9种，酶解后OAV≥1的挥发性化合物增加，香气轮廓更加丰富。与上述结果一致，低阈值的醛类对香气是贡献最大的，其OAV也大。酶解后鸡骨液中己醛（OAV：147.51）、辛醛（OAV：232.33）、壬醛（OAV：16.89）、苯甲醛（OAV：5.17）、反,反-2,4-癸二烯醛（OAV：706.33）、1-辛烯-3-醇（OAV：346.67）、庚醇（OAV：3.25）、己酸乙酯（OAV：0.54）的含量及OAV下降，降低了挥发性物质产生的花香、果香以及蜡味等香气，但是芳樟醇（OAV：2.29）、正壬醇（OAV：16.82）、2-戊基呋喃（OAV：59.49）、2-正丁基呋喃（OAV：1.11）、2-辛烯醛（OAV：160.45）、反式-2-癸烯醛（OAV：180.97）、庚醛（OAV：3.95）的含量及OAV上升，增加了瓜香、肉香、烘烤香、动物油脂味，使整体风味更加和谐。

表6 鸡骨液酶解前后挥发性风味物质的OAVTable 6 OAV of volatile flavor compounds of chicken bone homogenate before and after enzymatic hydrolysis

鸡骨液酶解前后的挥发性香气包含了水果香、花香、脂肪香、瓜香、草味、烘烤香、肉香、蘑菇、柠檬味和绿豆味。根据香气化合物的风味特征，以及参照香气轮中的模块分类可以将计算得到OAV≥1的各香气化合物绘制香气轮廓图[30]。如图3所示，酶解后香气轮廓比酶解前小，特别酶解前呈脂肪味的挥发性组分总OAV达到了2415.38，使鸡骨液的脂肪味过于凸出，而掩盖其它化合物的香气，但是酶解后下降到了1081.48，相比于与酶解前减小了2.23倍，很大程度的降低了脂肪味；虽然酶解会降低呈花香、果香果香的化合物浓度，但是增加了呈烘烤、绿豆、瓜香和肉香化合物的浓度，从而让鸡骨酶解液香气更丰富，接受度会更高，与郑晓杰等[31]的研究结果相似。

图3 鸡骨液酶解前后风味轮廓Fig.3 Flavor profile of chicken bone homogenate before and after enzymatic hydrolysis

3 结论

鸡骨是肉鸡加工过程中产生的主要可利用副产物，含有丰富的蛋白质、氨基酸等，具有较好的开发价值。本研究发现，共有13个游离氨基酸的TAV大于1，其中天门冬氨酸（13.85）、谷氨酸（78.92）、丙氨酸（24.60）、缬氨酸（41.09）、蛋氨酸（32.30）、异亮氨酸（16.52）、亮氨酸（13.97）和赖氨酸（81.99）大于10，对鸡骨液滋味贡献极大。共鉴定出挥发性化合物92种，酶解前63种，酶解后66种，其中OAV≥1酶解前13种、酶解后16种，包括醇类4种、酯类2种、呋喃类2种、醛类，酶解前鸡骨液有强烈的脂肪味，酶解后脂肪味减弱其OAV降低了2.23倍，同时花香、果香香气贡献减低，但是增加了烘烤、绿豆、瓜香和肉香的贡献。可为今后鸡骨酶解风味的研究提供试验基础和理论依据，但是为了更准确的对其香气轮廓的表征，在后续的研究中可以增加嗅闻、香气缺失和香气重组等试验。