miR-141对老年骨质疏松性骨折大鼠预后的影响及相关机制

伏守用 宋国 梅皓 苏杭 金龙浩 (延边大学附属医院(延边医院)骨一科，吉林 延边 133000)

随着年龄增长，骨质疏松发生率明显提升，骨骼风险相应增加〔1〕。骨质疏松性骨折患者生活质量下降的同时也占用了大量医疗资源。虽然近年来骨质疏松治疗取得了明显进步，涌现出了合成代谢、抗再吸收等多种药物，但总体治疗效果仍不够理想〔2〕。研发加速骨修复过程的新治疗方案对改善骨质疏松性骨折患者预后具有重要意义。小分子RNA(miRNA)在调节基因表达方面作用明显，能够参与调控骨质疏松的发生与发展及骨折的修复过程〔3〕。本研究经miRBase数据库预测，miR-141可与Notch1靶向结合。Notch信号通路参与介导骨骼发育、骨重塑、组织重生过程，表达异常会引发多种骨骼疾病〔4〕。本研究旨在探讨miR-141对老年骨质疏松性骨折大鼠预后的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1动物与主要试剂 18月龄Wistar大鼠76只均为雌性，体重(350±50)g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2020-0004。温湿度恒定，灯光模拟昼夜交替，标准固体饲料喂养，引用蒸馏水。人肾上皮细胞系293T细胞购于上海通派生物有限公司；miR-141 mimic、miR-nc、miR-141抑制剂、Notch1 siRNA均购于上海权阳生物有限公司；Trizol试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒购于北京赛尔瑞成生物科学有限公司。骨形态发生蛋白(BMP)-2一抗购于北京中科物源生物有限公司。

1.2骨质疏松大鼠模型建立与检测 大鼠术前禁食6 h，按3 ml/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，骨质疏松模型组60只大鼠在无菌条件下经背部入路，切除双侧卵巢；假手术组16只同样经背部入路，但不切除双侧卵巢，仅切除卵巢周围相同质量的脂肪组织。之后自由饮食，饲养3个月，随机数字法从60只骨质疏松模型组大鼠中选取8只，从假手术组中选取8只，再次麻醉，测量骨密度和股骨端组织标本组织中miR-141、Notch1基因表达情况。

1.3骨质疏松性骨折大鼠模型建立与分组 随机选取骨质疏松模型大鼠40只，禁食6 h，按3 ml/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，随机选取大鼠单侧股骨，剃毛并用碘伏消毒后，做股骨中点外侧纵行切开骨膜，锯断股骨后使用克氏针进行髓内固定，缝合切口。根据随机数字法分为骨质疏松性骨折模型组、阴性对照组(转染miR-141抑制剂阴性对照)、miR-141抑制剂组(转染miR-141抑制剂)、Notch1 siRNA干扰组(转染Notch1 siRNA)、miR-141抑制剂+Notch1 siRNA干扰组(转染miR-141抑制剂和Notch1 siRNA)，每组8只。具体转染方法：骨折手术7 d后，向对应大鼠皮下注射200 μl含转染试剂的核酸溶液，1次/w，连续注射4 w，进行后续实验。同时取假手术组8只大鼠，骨折模型建立方法与骨质疏松模型大鼠一致。

1.4双荧光素酶报告实验 使用miRBase数据库预测miR-141与Notch1的结合位点，进行双荧光素酶报告实验验证二者的靶向调节作用。将Notch1基因非编码区端野生型质粒克隆至应该报告质粒中，之后分别与miR-141 mimic、miR-nc共转染至293T细胞中，分为Notch1/miR-nc组、Notch1/miR-141 mimic组，每组设5个平行对照，转染48 h后使用双荧光素酶报告试剂盒检测荧光活性，以海肾荧光素酶为内参计算萤火虫荧光素酶活性的相对值。

1.5qRT-PCR检测miR-141、Notch1表达水平 Trizol试剂盒提取各组股骨断端组织总RNA，测定浓度和纯度后取3 μg RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，逆转录成互补DNA。PCR扩增引物由上海士锋生物有限公司设计合成，miR-141正向引物：5′-GTTCTGGATGGACAGGTCGACCTC-3′，反向引物：5′-ACCTCGGGAGTTGACTTAACGGCTGA-3′。Notch1正向引物：5′-TCCATCTGCTACCTCGGT-3′，反向引物：5′-CTTACTCTGCCACTGCTA-3′。GAPDH正向引物：5′-TTCAGTCTCCTCTGGTGGACC-3′，反向引物：5′-GCTTAGCGATGATTCGTTGA-3′。PCR反应设定条件：94℃预变性2 min，95℃变性30 s，57℃复性30 s，共45个循环，72℃延伸1 min。以2-△△Ct表示目的基因的表达水平。

1.6各组骨组织中BMP-2表达的免疫组化检测 取各组大鼠股骨断端组织，常规固定、脱钙、石蜡包埋后5 μm切片，脱蜡并水化组织切片，高压热修复抗原。使用3%过氧化氢室温下处理10 min，使内源性过氧化物酶失活，5%正常山羊血清封闭，37℃静置10 min，滴加BMP-2一抗(1∶500稀释)，4℃孵育12 h，次日滴加相应的二抗(1∶2 000稀释)，37℃孵育1 h，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，蒸馏水冲洗后脱水、透明、封片，光学显微镜下每张切片随机选择一个视野，棕黄色为BMP-2阳性表达，计数BMP-2阳性细胞个数。

1.7骨密度和生物力学检测 分别于干预14、28、42、56 d时使用双能X射线骨密度仪检测手术侧股骨的骨密度值。干预56 d时去除大鼠手术侧股骨周围肌肉等软组织，拔除克氏针后进行三点弯曲实验，测定极限应力、剪切应力、最大负载。

1.8统计学分析 采用SPSS24.0软件进行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1两组骨密度及miR-141、Notch1基因表达水平比较 骨质疏松组骨密度明显低于假手术组(P<0.01)；骨质疏松组miR-141表达水平明显高于假手术组，Notch1表达水平明显低于假手术组(P<0.05)。见表1。

表1 两组骨密度及miR-141、Notch1基因表达水平比较

2.2miR-141与Notch1靶向结合关系 两组内参海肾荧光素酶荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)；Notch1/miR-141 mimic组萤火虫荧光素酶荧光强度及萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶比值均明显低于Notch1/miR-nc组(P<0.05)。见表2。

表2 miR-141与Notch1靶向结合关系的双荧光素酶实验结果

2.3各组体内miR-141、Notch1表达水平比较 miR-141抑制剂组、miR-141抑制剂+Notch1 siRNA干扰组miR-141表达水平(0.57±0.05、0.64±0.09)低于骨质疏松性骨折模型组(1.82±0.13)、阴性对照组(1.89±0.11)、假手术组(1.01±0.09)，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-141表达水平在骨质疏松性骨折模型组、阴性对照组、miR-141抑制剂组(0.57±0.05)之间差异无统计学意义(P>0.05)。Notch1 siRNA干扰组Notch1表达水平(0.38±0.05)低于骨质疏松性骨折模型组(0.72±0.11)、阴性对照组(0.70±0.07)、假手术组(1.00±0.07)，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-141抑制剂组(0.91±0.14)、miR-141抑制剂+Notch1 siRNA干扰组(0.79±0.07)Notch1表达水平高于Notch1 siRNA干扰组、骨质疏松性骨折模型组、阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；Notch1表达水平在骨质疏松性骨折模型组、阴性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4各组骨组织中BMP-2表达比较 BMP-2主要分布于成骨细胞的胞质内和骨小梁周围。假手术组阳性细胞数〔(157.00±16.00)个〕多于骨质疏松性骨折模型组〔(46.00±9.00)个〕，差异有统计学意义(P<0.01)；阳性细胞数在阴性对照组〔(48.00±11.00)个〕与骨质疏松性骨折模型组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)；miR-141抑制剂组阳性细胞数〔(139.00±18.00)个〕多于骨质疏松性骨折模型组、阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-141抑制剂+Notch1 siRNA干扰组〔(105.00±13.00)个〕低于miR-141抑制剂组，但与Notch1 siRNA干扰组〔(32.00±7.00)个〕相比明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组骨组织中BMP-2表达(SP法，×200)

2.5不同干预时间各组骨密度比较 除假手术组之外，其他各组随着干预时间的延长骨密度呈逐渐上升趋势；各干预时间点，骨质疏松性骨折模型组和阴性对照组明显低于假手术组(P<0.05)；阴性对照组与骨质疏松性骨折模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；miR-141抑制剂组明显高于骨质疏松性骨折模型组、阴性对照组(P<0.05)；miR-141抑制剂+Notch1 siRNA干扰组明显低于miR-141抑制剂组，但与Notch1 siRNA干扰组相比明显升高(P<0.05)。见表3。

表3 不同干预时间各组骨密度比较

2.6干预56 d后各组股骨生物力学指标比较 骨质疏松性骨折模型组和阴性对照组极限应力、剪切应力、最大负载明显低于假手术组(P<0.05)；阴性对照组与骨质疏松性骨折模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；miR-141抑制剂组各股骨生物力学指标均明显高于骨质疏松性骨折模型组、阴性对照组(P<0.05)；miR-141抑制剂+Notch1 siRNA干扰组均明显低于miR-141抑制剂组，但与Notch1 siRNA干扰组相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 干预56 d后各组股骨生物力学指标比较

3 讨 论

随着我国经济的快速发展和人口老龄化进程的加剧，骨质疏松已成为影响居民健康的主要疾病之一，由于骨质疏松患者骨骼质量较差，对于合并骨质疏松的骨折患者治疗难度明显增加〔5〕。随着近年来分子生物学技术的快速发展，对miRNA的研究不断深入，基于miRNA的分子靶向疗法在临床多种疾病的治疗中展现出了较大潜力，其中包括对骨质疏松及合并骨折患者的治疗〔6〕。相关研究显示，miR-210能够抑制破骨细胞活性和骨再吸收，用于骨质疏松的临床治疗〔7〕。亦有研究显示，miR-128能够调节人间充质干细胞的成骨分化，影响骨质疏松的发生与发展〔8〕。Notch受体参与调节人体内环境稳态和骨骼发育过程，骨细胞中Notch激活后能够明显提升骨骼质量〔9〕，同时能够抑制骨再吸收，促进骨骼发育成熟〔10,11〕。本研究结果提示miR-141、Notch1在骨质疏松性骨折大鼠中存在异常表达。

本研究结果说明miR-141与Notch1之间存在靶向关系。BMP-2具有诱导骨再生的活性，能够促进骨髓间充质肝细胞向成骨细胞分化，促进骨形成和骨骼再生〔12,13〕。本研究结果提示Notch1低表达能够明显抑制骨质疏松性骨折大鼠骨组织中BMP-2表达，抑制miR-141表达可能通过上调Notch1表达水平来促进BMP-2阳性表达。

进一步分析各组大鼠骨密度和生物力学改变情况，结果提示抑制miR-141能够明显提升骨质疏松性骨折大鼠的骨密度及生物力学相关指标；抑制Notch1后骨质疏松性骨折大鼠的骨密度及生物力学相关指标明显降低，而抑制miR-141能够逆转上述改变。可推测抑制Notch1能够促进Notch1表达来促进骨质疏松性骨折大鼠的骨骼修复。

综上，miR-141与Notch1靶向结合能够影响骨质疏松性骨折大鼠骨代谢和生物力学相关指标的改变。通过抑制miR-141表达能够上调Notch1表达，提升骨质疏松性骨折大鼠骨组织中BMP-2的阳性表达率，进而提升骨密度和生物力学强度，促进骨折愈合。