miR-335靶向调控CCL5对AngⅡ诱导心肌成纤维细胞纤维化的影响

黄皓章 邓家强 (南宁市第一人民医院心血管内科二区，广西 南宁 530021)

当心脏受损或产生应激反应时，心肌成纤维细胞(CFs)激活，细胞增殖使细胞外基质胶原蛋白沉积过多，而沉积的胶原蛋白在细胞因子、生长因子和酶相互作用下变硬，更难被对应的蛋白酶分解，就导致心肌纤维化〔1,2〕。心肌纤维化使心肌供氧和营养物质不足，导致心肌生物电效应和结构改变，使患者易患心律失常、心力衰竭和缺血性心脏病等〔3〕。目前临床主要是通过药物防治或逆转心肌纤维化，但药物副作用较大，难以达到预期的效果。因此，迫切需要一种方法治疗CFs纤维化。研究报道微小RNA(miRNA)可调节不同类型的纤维化疾病〔4〕，其中miR-335有显著抗肝纤维化作用〔5〕，但是对CFs纤维化相关研究较少，本研究旨在探讨miR-335在血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导CFs纤维化中作用，并初步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1试剂 人CFs(货号HUM-CELL-0016)购自武汉原生原代生物医药科技有限公司，DMEM/F12培养基(货号A4192001)购自美国Gibco公司，胎牛血清(FBS，货号SH30396.03)购自美国Hyclone公司，RNA提取试剂Trizol(货号5301005)购自杭州新景生物试剂开发有限公司,反转录试剂盒(货号RR047A)购自日本TaKaRa公司,双荧光素酶活性检测试剂盒(货号E1910)购自美国Promega 公司,Lipofectamine3000(货号L3000001)购自美国ThermoFisher公司,荧光素酶报告基因质粒由上海和元生物有限公司设计并构建。人Ⅰ型胶原蛋白(COL)-Ⅰ酶联免疫吸附试验(EILISA)试剂盒(货号H142)、COL-Ⅲ ELISA试剂盒(货号H144)均购自南京建成生物工程研究所，人转化生长因子(TGF)-β ELISA试剂盒(货号ml064258)、人结缔组织生长因子(CTGF) ELISA试剂盒(货号ml025961-2)购自上海酶联生物科技有限公司，趋化因子(CCL)5抗体(货号bs-20765R)购自北京博奥森生物技术有限公司，AngⅡ(货号P186)购自美国Sigma公司。

1.2仪器 单光子检测仪(型号SPY-D-II)购自上海中庸检验设备有限公司，实时荧光定量-聚合酶链反应qRT-(PCR)仪(型号1C480)购自瑞士Roche公司，二氧化碳培养箱(型号GALAXY)购自英国RSBiotech公司，电泳仪(型号1658001)购自美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养 人CFs接种于无菌细胞培养瓶中，放置37℃、5%CO2培养箱中培养，每3 d换液，并观察细胞形态，待细胞长至80%～90%时，消化传代，取对数生长期细胞进行以下实验。

1.3.2采用AngⅡ诱导CFs纤维化模型 CFs经0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min离心5 min，重悬细胞，调整细胞密度为2×105/ml，以每孔2 ml含AngⅡ终浓度为1×10-6mol/L的DMEM/F12完全培养基接种于六孔板中，每组均设6个复孔，空白对照组加入同体积不含AngⅡ的完全培养基，放置培养箱中培养。

1.3.3转染分组 24 h后取出1.3.2中细胞，分别用不含血清的培养基稀释pcDNA3.1-NC质粒和pcDNA3.1-miR-335 mimic质粒与Lipofectamine3000混合均匀，按照Lipofectamine3000说明书给予AngⅡ处理的细胞转染。实验分为空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+NC组、AngⅡ+miR-335 mimic组，每组6个复孔，继续培养，6 h后以每孔2 ml更换新鲜完全养基继续培养。

1.3.4qRT-PCR检测miR-335、CCL5 mRNA相对表达 各组转染48 h后弃培养基，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，提取总RNA，由引物合成软件Primer Premier 6.0设计引物序列，miR-335：正义链：5′-TCAAGAGCAATAACGAAAAATGT-3′，反义链：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3′；CCL5：正义链：5′-GACAGCACGTGGACCTCGCA-3′，反义链：5′-TTGA-TGTGGGCACGGGGCAG-3′；U6：正义链：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反义链：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′；β-actin：正义链：5′-GCACCGTCMGG-CTGAGMC-3′，反义链：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。用反转录试剂盒对RNA合成cDNA，并扩增，严格按照定量PCR试剂盒说明书配制反应体系，以U6、β-actin为对照，反应条件是95℃预变性15 min、90℃变性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸50 s，40个循环。收集各组Ct值进行数据分析，计算目的基因相对于内参基因的表达量用2-ΔΔCt表示。

1.3.5采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测观察CFs的增殖 取出1.3.3中细胞转染后24、48、72 h，每孔加入20 μl 浓度0.5% MTT溶液，继续培养4 h，吸出培养基，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min，待结晶溶解后在酶标仪波长570 nm处测吸光度值(OD值)。细胞增殖率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3.6双荧光素酶报告基因检测 根据CCL5基因序列信息,使用 TargetScan 软件预测CCL5基因3′UTR与miR-335可能存在的结合位点，构建含有CCL5的野生型和突变型3′UTR序列的荧光素酶报告基因质粒(CCL5-Wt和CCL5-Mut)与miR-335 mimic、NC共染至CFs，48 h后收集细胞。按照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书操作，使用单光子检测仪检测荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值，每组实验设6个复孔。

1.3.7ELISA检测COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF 取出COL-Ⅰ试剂盒，室温复温30 min，1.3.3中CFs转染24 h后，分别收集各组细胞上清液，严格按照ELISA说明书操作，测定450 nm波长下OD值，根据标准品的浓度和OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据所测样本的平均OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，乘以稀释倍数算出样本中各组CFs中COL-Ⅰ含量。同样方法测定各组细胞中COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF的含量。

1.3.8Western印迹检测各组细胞中CCL5 相对表达量 转染后培养48 h，每组细胞PBS清洗，加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白的浓度，按照4∶1在蛋白中加5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液，沸水浴加热3～5 min，放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝胶配方表制备12%分离胶和5%浓缩胶，上样量20 μg，上样后进行蛋白凝胶电泳，根据蛋白marker切胶，转膜，加入抗体CCL5(1∶500稀释)、β-actin(1∶1 000)孵育，放置4℃过夜，TBST清洗，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育1 h，TBST清洗后，参考电化学(ECL)发光液说明书对条带孵育、曝光、显影。Image J对条带灰度值分析。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1过表达miR-335对CFs细胞中miR-335、CCL5 mRNA表达水平的影响 与空白对照组相比，AngⅡ组、AngⅡ+NC组CFs细胞中miR-335相对表达水平显著降低，CCL5 mRNA相对表达水平显著升高(P<0.05)；AngⅡ+miR-335 mimic组细胞中miR-335、CCL5 mRNA相对表达水平无显著差别(P>0.05)。与AngⅡ组、AngⅡ+NC组相比，AngⅡ+miR-335 mimic组细胞中miR-335相对表达水平显著升高，CCL5 mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞中miR-335和CCL5 mRNA相对表达水平

2.2miR-335-5过表达对细胞中CCL5蛋白相对表达水平的影响 与空白对照组CCL5蛋白表达水平(0.43±0.10)相比，AngⅡ组、AngⅡ+NC组〔(0.95±0.12)、(0.89±0.11)〕显著升高(P<0.05)，AngⅡ+miR-335 mimic组(0.42±0.09)无显著变化(P>0.05)。与AngⅡ组、AngⅡ+NC组相比，AngⅡ+miR-335 mimic组细胞中CCL5蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05)。见图1。

1～4:空白对照组、Ang Ⅱ组、AngⅡ+NC组、AngⅡ+miR-335 mimic组图1 各组细胞中CCL5蛋白相对表达水平

2.3miR-335过表达对各组CFs细胞增殖能力影响 与空白对照组比较，同一时间AngⅡ组、AngⅡ+NC组中CFs细胞增殖率显著升高(P<0.05)，AngⅡ+miR-335 mimic组无显著差异(P>0.05)；与AngⅡ组、AngⅡ+NC组相比，AngⅡ+miR-335 mimic组AngⅡ诱导CFs细胞增殖率显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 miR-335过表达对AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖率比较

2.3miR-335-5过表达对CFs细胞COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF含量影响 与空白对照组相比，AgⅡ组、AngⅡ+NC组细胞中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF含量显著升高(P<0.05)，AngⅡ+miR-335mimic组细胞中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF含量差异无统计学意义(P>0.05)。与AgⅡ组、AngⅡ+NC组相比，AngⅡ+miR-335mimic细胞中COL-Ⅰ,COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF含量显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 CFs细胞COL-Ⅰ,COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF相对表达量

图2 TargetScan 软件预测CCL5基因靶向

2.4miR-335与CCL5存在靶向作用 TargetScan 软件预测CCL5 3′UTR与miR-335存在结合位点。见图2。与miR-335 NC+WT-CCL5 3′UTR组荧光素酶相对活性(2.47±0.31)比较，miR-335 mimic+CCL5 3′UTR组(1.69±0.29)显著降低(P<0.05)；miR-335 NC+MUT-CCL5 3′UTR组(2.44±0.35)、miR-335 mimic+MUT-CCL5 3′UTR组(2.40±0.27)荧光素酶相对活性差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

心肌纤维化主要是CFs过度增殖和胶原蛋白表达、分泌过多引起的，通常伴随着心肌肥厚、心肌梗死等病理学变化，是冠心病、高血压性心脏病等多种心血管疾病发生的共同基础〔6〕。心肌纤维化涉及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ等编码细胞外基质蛋白和TGF-β、CTG等细胞因子调节参与〔7〕。研究表明AngⅡ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要成分，可促进CFs细胞增殖、胶原蛋白堆积诱导CFs纤维化，因此广泛使用AngⅡ为刺激因子建立心肌纤维化模型〔8〕。本研究结果提示AngⅡ诱导CFs细胞纤维化模型成功。

miRNA是近年来发现小分子非编码RNA，通过与靶mRNA的碱基配对，调节细胞凋亡、增殖、生理和病理生理过程等生物学功能，并在转录后发挥作用〔9〕。研究表明miRNA参与调节CFs纤维化，如miR-133在心肌细胞和CFs中均有表达，研究发现miR-133低表达可引起心肌胶原蛋白和细胞外基质表达及分泌增加，与心肌纤维化有关〔10〕。已有报道在肝纤维化的发病机制中，miR-335有抗纤维化作用〔11〕。miR-335在肝星状细胞活化和肝纤维化过程中显著降低，恢复miR-335的表达可抑制肝星状细胞的迁移和降低COL-Ⅰ表达〔12〕。本研究结果提示miR-335表达降低可能与心肌CFs纤维化有关；miR-335过表达模型建立成功。心肌纤维化与CFs大量增殖有关〔13〕，已有研究发现miR-335抑制肺成纤维细胞的增殖〔14〕，此外敲除miR-335-3p可促进人牙龈成纤维细胞的成纤维活性〔15〕。本研究结果提示AngⅡ促进心肌CFs增殖，miR-335过表达抑制AngⅡ诱导心肌CFs的增殖。

细胞外基质的主要成分是胶原蛋白，包括COL-Ⅰ、COL-Ⅲ，过量胶原蛋白堆积于组织间隙，胶原纤维降解失衡，导致心肌纤维化〔16〕。心肌纤维化形成和发展同时伴随多种细胞因子的参与，主要是CTGF和TGF-β，其中CTGF可直接诱导胶原生成，促进纤维化发生，TGF-β可促进细胞增殖和细胞外基质聚集，同时也诱导CTGF生成〔17,18〕。本研究结果提示miR-335过表达可能通过下调COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF水平改善心肌CFs纤维化。研究表明CCL5在肝纤维化中起着关键性调节作用，首先肝细胞中过多CCL5可刺激肝星状细胞增殖、迁移，增加胶原生成；其次CCL5可与受体CCR5结合诱导正常肝细胞脂肪变性，产生促炎性因子，促进肝纤维化〔19〕。此外，研究发现CCR2和CCR5及其配体CCL2和CCL5之间的相互作用通过促进单核/巨噬细胞的募集和组织浸润，介导纤维化的发生〔20〕。本研究结果提示CFs纤维化可能与上调CCL5表达有关；双荧光素酶报告基因检测实验证实miR-335能够靶向CCL5；miR-335过表达可下调CCL5相对表达。

综上，miR-335可能通过靶向调控CCL5，降低COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、CTGF水平，改善AngⅡ诱导的CFs纤维化，提示CCL5可能作为抗心肌纤维化的靶点。