山莨菪碱调控线粒体功能改善大鼠再生障碍性贫血的机制

王光红 刘盼 何环宇 (成都市郫都区人民医院肿瘤血液科，四川 成都 611730)

再生障碍性贫血是一种骨髓造血功能衰竭性综合征，是临床发病率较高的造血系统疾病，以贫血、出血和感染为主要表现，青壮年期和老年期为发病高峰期〔1〕。再生障碍性贫血发病机制尚未明确，化学物质、生活环境、遗传变异及免疫功能紊乱均可能引起该病的发生，有研究显示再生障碍性贫血患者的T淋巴细胞活性异常，影响了机体造血干细胞增殖和凋亡平衡〔2〕。山莨菪碱(ADM)是一种抗胆碱药物，已在临床应用了多年，随着现代科学技术的发展，发现ADM除了具有抗胆碱作用外还有广泛的药理作用，可以扩张血管，减少红细胞和血小板凝集，促进血细胞分散，改善贫血〔3〕，还可以改善组织、器官的微循环，可被应用到其他疾病的治疗中〔4〕，本文拟分析ADM调控线粒体功能改善大鼠再生障碍性贫血的机制。

1 材料与方法

1.1材料 雄性SPF级SD大鼠30只，体重(200±20)g，购于成都达硕实验动物有限公司，实验单位使用许可证号 SCXK(川)2020-030。 ADM(CAS：55869-99-3，北京百灵威科技有限公司)；注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)；乙酰苯肼(CAS：114-83-0)；水合氯醛溶液(深圳海思安生物技术有限公司，货号：IP115)；白细胞介素(IL)-2和 IL-11 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(XL-EH00系列，上海鑫乐生物有限公司，中国)；JC-1试剂盒(上海李记生物科技有限公司，货号：AC12L073)。

1.2大鼠建模及给药 将SD大鼠按照体重随机分为正常组、模型组、ADM低、中、高剂量(0.25、0.50、1.00 mg/kg)组，每组6只。除正常组外，其余各组第1天和第4天皮下注射2%乙酰苯肼生理盐水溶液(20 mg/kg)，第4天2 h后及第5、6、7天腹腔内注射环磷酰胺生理盐水溶液(20 mg/kg)〔5〕，建造再生障碍性贫血动物模型。各给药组大鼠均注射ADM，正常组和模型组注射相同体积生理盐水，排除误差，连续给药15 d。

1.3样本采集 大鼠末次给药1 h后，取10%水合氯醛腹腔注射麻醉，每100 g重量注射0.3 ml。腹主动脉取血1 ml，保存在抗凝管中待用，取4 ml全血于促凝管中，离心后取上清液，-20℃保存待用。

1.4脏器指数测定 取10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，解剖大鼠，取出其胸腺和脾脏称重，然后计算各脏器指数。脏器(胸腺、脾脏)指数=脏器(胸腺、脾脏)质量(mg)/动物体重(g)。

1.5外周血象检测 血细胞分析仪检测大鼠外周血，各组于建模第8天静脉采血200 μl，检测白细胞计数(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)和网织红细胞(RET)情况，评估造模情况。第23天，采用同样方法检测各组大鼠外周血血象计数，评价各组不同浓度药物治疗的效果〔6〕。

1.6免疫功能检测 采用流式细胞仪检测大鼠外周血淋巴细胞各亚群比例〔7〕，检测免疫因素是否参与再障的发病。

1.7血清炎症因子水平检测 ELISA检测大鼠血清IL-2和IL-11水平。取冻存的血清样本，按照步骤，检测血清中 IL-2和 IL-11水平〔8〕，使用前将试剂盒内所有试剂充分混匀。加入标准品50 μl于反应孔，加入待测样品50 μl于反应孔内，立即加入50 μl生物素标记的抗体，37℃温育1 h，甩去孔内液体，加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作4次。每孔加入80 μl亲和链酶素，37℃温育30 min。甩去孔内液体，加满洗涤液，振荡30 s，拍干，重复此操作4次。 每孔加入底物50 μl，轻轻振荡混匀，37℃温育15 min。避免光照。取出酶标板，加入50 μl终止液后应立即测定结果。在450 nm波长处测定各孔光密度(OD)值。

1.8线粒体膜电位检测 JC-1 试剂盒检测线粒体膜电位，提取骨髓造血干细胞(LSK)后，取2×105细胞置于0.5 ml细胞培养液中，加入0.5 ml JC-1 染色液(AC12L073，李记生物科技有限公司，上海)，37℃细胞培养箱中放置15 min，4℃离心4 min，洗涤，重悬细胞，最后使用流式细胞仪分析线粒体膜电位〔9〕。

1.9统计学分析 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、LSD检验。

2 结 果

2.1各组脏器指数比较 模型组与正常组相比，脾脏指数显著升高，胸腺指数显著降低(P<0.05)。ADM低、中、高剂量组脾脏指数显著低于模型组，胸腺指数显著高于模型组(P<0.05)，见表1。

表1 各组脏器指数比较

2.2各组外周血象比较 模型组 WBC、Hb、PLT、RET水平较正常组显著降低(P<0.05)，说明造模成功。与模型组比较，ADM低、中、高剂量组显著升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组外周血象比较

2.3各组免疫功能比较 模型组CD3+T细胞、CD3+CD4+T 细胞比例显著低于正常组(P<0.05)，说明模型大鼠免疫功能异常。ADM中、高剂量组CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞比例显著高于模型组(P<0.05)，且随着剂量的增加，效果越显著，见表3。

表3 各组免疫功能比较

2.4各组IL-2和IL-11水平比较 模型组IL-2水平较正常组显著升高，IL-11水平显著降低(P<0.05)。ADM低、中、高剂量组IL-2含量明显低于模型组，IL-11水平明显高于模型组(P<0.05)，见表4。

表4 各组血清中IL-2和IL-11表达比较

2.5各组线粒体数量和LSK细胞线粒体膜电位水平比较 模型组线粒体数量及LSK细胞线粒体膜电位水平较正常组显著下降(P<0.05)；ADM低、中、高剂量组较模型组显著增加(P<0.05)，且随着剂量的增加，效果越显著，见表5。

表5 各组线粒体数量和LSK细胞线粒体膜电位水平比较

3 讨 论

ADM可以促进血细胞分散，减少细胞破坏，改善贫血。且该药物的安全性高，不良反应小，一般减量或停药后不良反应可消失或减轻。再生障碍性贫血的病情进展迅速，患者常死于严重的出血或感染〔10〕。

脾脏器官在受到外界感染时，由于免疫细胞浸润、脾功能亢进等会引起脾变大，本研究结果与王馨等〔11〕研究结果一致。胸腺产生T淋巴细胞，ADM增加了大鼠的胸腺指数，增强了大鼠免疫力。

ADM改善了再生障碍性贫血模型大鼠的外周血细胞比例，有研究表明，Hb数值越高，临床疗效越明显〔12〕。重型再障的致病机制中，T淋巴细胞功能异常占有重要地位〔13〕。有研究发现再生障碍性贫血患者CD3+CD4+T淋巴细胞减少，导致细胞的不同亚群之间的平衡被打破，抑制造血干细胞的功能〔14〕。ADM能有效升高CD3+CD4+T细胞比例，改善免疫功能。

IL-2能够促进细胞凋亡，是一种负性造血调节因子，郭媛媛〔15〕研究表明经治疗后再生障碍性贫血患者IL-2水平显著降低；ADM升高了 IL-11 水平，使负性造血调节因子 IL-2 的含量明显降低，抑制了细胞凋亡。大鼠模型中LSK细胞中线粒体的数量降低，说明线粒体功能出现异常。ADM可以增加线粒体数量和LSK细胞线粒体膜电位水平。

综上，ADM能够改善大鼠的再生障碍性贫血，其作用机制可能是通过增加线粒体数目、稳定线粒体膜，从而恢复造血干细胞功能来实现。