脐带血miR-499-5p、PTEN在缺氧缺血性脑病新生儿中的水平变化及临床意义

王红娥

新郑市人民医院新生儿科，河南郑州 451100

新生儿出生前、出生时和出生后窒息是导致新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)发病和死亡的重要因素。25%的新生儿HIE会出现严重的永久性神经系统后遗症，包括智力低下、脑瘫和癫痫等[1]。微小RNA (miRNA) 是一组非编码RNA，长度为18～22个核苷酸，其在人体体液中稳定存在，并且可以从血清中检出[2]。miRNA已被证明与多种疾病的发病机制有关，可以作为较好的疾病诊断指标[3]。微小RNA-374a和微小RNA-181b与HIE疾病进展有关[4]。 最近的一项研究显示，微小RNA-499-5p(miR-499-5p)可抑制C反应蛋白的产生并在新生大鼠HIE中发挥神经保护功能[5]。位于人类19号染色体上的磷酸酯酶与张力蛋白同源物 (PTEN) 基因编码一种双磷酸酶，可使蛋白质和脂质底物脱磷酸化[6]。此外，PTEN是磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt) 信号通路的负调节因子，与缺氧缺血性损伤有关[7]。PTEN可调节肿瘤组织和健康组织中的血管生成，而脑微血管生成对于脑损伤后功能恢复是非常必要的[8]。然而，目前尚不明确脑组织中miR-499-5p减轻缺血缺氧损伤的功能是否依赖于PTEN信号通路。因此，本研究对HIE新生儿脐带血中的miR-499-5p、PTEN水平进行了分析，并探讨其关系，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月至2020年4月本院收治的61例HIE新生儿为研究对象，纳入标准：(1)足月新生儿；(2) HIE诊断通过脑部MRI证实。排除标准：(1)合并颅内出血、电解质紊乱或产伤引起的惊厥；(2)合并高胆红素血症、宫内感染或严重脑发育不良引起的脑损伤。根据新生儿HIE严重程度判断标准，将HIE新生儿分为HIE轻度、中度和重度组,分别为27例、21例、13例。选取同期50例健康新生儿作为对照组，对照组均为新生儿疾病筛查无异常且无围生期窒息或神经系统疾病的新生儿。各组新生儿性别、分娩方式、体质量、胎龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究经本院医学伦理委员会批准。

表1 各组一般资料比较

1.2方法

1.2.1指标检测 (1)出生后6 h内从新生儿的股静脉采集血液标本，4 ℃下离心，分离血清，采用酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测S100B和神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平。(2)在新生儿出生后1 h内采集脐带血，离心分离血清，采用Trizol试剂(美国，赛默飞世尔)从脐带血中提取总RNA，使用miRNA RT-PCR试剂盒(日本，Takara)将其逆转录为cDNA；分别采用U6和GAPDH作为内参，采用SYBR Green Ⅰ Master Mix 试剂盒(美国，赛默飞世尔)检测miR-499-5p、PTEN水平。miR-499-5p上游引物5′-GGCCGTTAAGACTTGCAGTG-3′，下游引物5′-GGGAAGCAGCACAGACTTG-3′，长度92 bp；PTEN上游引物5′-TGTGGTCTGCCAGCTAAAGG-3′，下引物5′-CGGCTGAGGGAACTCAAAGT-3′，长度94 bp;U6上游引物5′-CGAGCGCCACTTCAGAATA-3′，下游引物5′-CTCACGGCGCTTCATCAGAT-3′，长度139 bp；GAPDH上游引物5′-CGGATGCACCAATGTTCGTC-3′，下游引物5′-ACGCGTTGCTCACAATGTTC-3′，长度78 bp。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 25 s，75 ℃ 15 s，40个循环。 使用2-ΔΔCt法计算miR-499-5p、PTEN水平。

1.2.2新生儿行为神经测定(NBNA)评分 新生儿出生后第7天进行NBNA评分，包括主动能力、被动肌张力、主动肌张力、原始反射和一般评价5个部分，总分40分，NBNA评分<35分为异常。

1.2.3Gesell发育诊断量表评价 HIE新生儿在出生后40周和52周时采用Gesell发育诊断量表进行智能评价，并计算发展商数(DQ)。

2 结 果

2.1各组检测指标及NBNA评分比较 HIE轻度、中度、重度组miR-499-5p水平、NBNA评分明显低于对照组，PTEN、S100B、NSE水平明显高于对照组，且随着HIE严重程度的增加，miR-499-5p水平、NBNA评分逐渐下降，PTEN、S100B、NSE水平逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组检测指标及NBNA评分比较

2.2miR-499-5p、PTEN、S100B、NSE诊断新生儿HIE的效能 miR-499-5p、PTEN、S100B、NSE单独检测诊断新生儿HIE的曲线下面积(AUC)分别为0.824、0.698、0.816、0.781；上述指标联合检测的AUC为0.896。

2.3miR-499-5p靶向PTEN的表达 Starbase在线软件预测到miR-499-5p与PTEN存在结合位点chr10:89729614-89729621[+]，见图1。

图1 miR-499-5p靶向PTEN的表达

2.4各组DQ比较 HIE轻度、中度、重度组出生后40周、52周时的DQ明显低于对照组，且随着HIE严重程度的增加，新生儿出生后40周、52周时的DQ逐渐下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组40周、52周时的DQ比较

2.5DQ与miR-499-5p、PTEN、S100B、NSE水平的相关性分析 相关性分析结果显示，HIE新生儿miR-499-5p水平与出生后40周、52周时的DQ呈正相关(P<0.05),PTEN、S100B 、NSE水平与出生后40周、52周时的DQ呈负相关(P<0.05)，见表4。

表4 DQ与miR-499-5p、PTEN、S100B、NSE水平的相关性分析

3 讨 论

早期诊断、及时治疗对于降低HIE新生儿神经系统后遗症的发生率至关重要。S100B是一种胶质神经营养蛋白，主要位于胶质细胞和施万细胞中，在星形胶质细胞的增殖、分化和神经系统病变中扮演着重要角色[9]。NSE是反映神经元损伤严重程度的生物标志物，神经元退行性病变、坏死或血脑屏障破坏时其水平显著升高。NSE在HIE严重程度评估方面具有较高的准确性，还可以作为HIE诊断和预后判断的生物标志物[10]。本研究中，HIE新生儿与健康新生儿比较，S100B、NSE水平明显升高，且随着HIE严重程度的增加，S100B、NSE水平逐渐升高，提示S100B、NSE与HIE的发生、发展有关。进一步评估S100B、NSE对HIE的诊断效能，结果显示，AUC分别为0.816、0.781，具有一定价值。然而S100B、NSE水平升高也可以在其他疾病中被检测到，包括新生儿感染性脑损伤。

研究发现，miR-499-5p在大鼠心肌梗死区域水平降低，同时在心力衰竭大鼠模型中其表达也明显下调，miR-499-5p通过保护心肌细胞免受应激诱导的细胞凋亡而发挥心脏保护作用，通过靶向钙调神经磷酸酶和动力蛋白相关蛋白-1减少细胞凋亡，从而减轻心肌梗死和心脏功能障碍的严重程度[11]。研究表明，miR-499在改善脑损伤后运动功能和神经功能方面发挥着一定作用[12]。PTEN位于人类19号染色体上，编码一种使蛋白质去磷酸化的磷酸酶，对PI3K/Akt信号通路具有负调节作用，可调控缺氧缺血性损伤；此外，PTEN还可以调节血管生成，对于脑损伤的功能恢复有重要作用[8，13]。本研究中，HIE新生儿的miR-499-5p水平明显低于健康新生儿，PTEN明显高于健康新生儿，且随着HIE严重程度的增加，miR-499-5p水平逐渐下降，PTEN水平逐渐升高，提示miR-499-5p、PTEN与HIE的发生、发展有关。进一步通过Starbase在线软件预测到miR-499-5p与PTEN存在结合位点，miR-499-5p可能通过抑制PTEN水平，对HIE新生儿脑损伤起到保护作用。此外，本研究还发现，将NSE、S100B、miR-499-5p和 PTEN联合检测用于诊断HIE的效能最高，AUC为0.896，可用于HIE的临床辅助诊断；同时，上述4项指标与HIE新生儿出生后40周、52周时的DQ具有相关性，提示其与HIE新生儿的智能发展有关，在预后评估方面可能也具有一定的价值，有待临床深入研究。