九香虫水煎液对肝癌HepG2细胞体外生长的影响

杨 莎，蔡仁莲,，陈绪美，赵 帅，田 莹，郭建军*

(1.贵州大学 昆虫研究所/贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.遵义医科大学 组织学与胚胎学教研室，贵州 遵义 563000)

肝癌作为一种常见的恶性肿瘤，对人类的健康构成了严重的威胁。统计显示，2020年全球肝癌新发病例与死亡病例分别为905 677与830 180例，且死亡率超过胃癌，从2018年的第三顺位提升至2020年的第二顺位；在中国，肝癌的形势则更加严峻，2020年发病率与死亡率接近世界平均水平的两倍。目前肝癌的西医疗法主要有手术切除、动脉介入、放射疗法等，但面临复发与转移的风险，并伴随着一系列副作用；传统中医具有防癌变、抑恶化、促修复等作用，常成为癌症治疗的有效补充。

九香虫(Dallas,1851)隶属于昆虫纲Insecta半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae，为民间常见虫类中药，具有理气止痛、温中助阳的功效。随着现代药理学的发展，九香虫抗癌、抗菌、抗凝血等功能逐渐得以研究。研究表明，九香虫具有抗乳腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌等作用。在传统中药复方中，九香虫常与其他药物配伍使用，且水煎液为常用的给药方式，但对其水煎液单独作用于癌症的研究较少，仅见田莹等对乳腺癌的研究报道，对九香虫水煎液作用于肝癌的研究更是鲜有报道。本研究通过体外细胞试验，研究了九香虫水煎液对肝癌细胞HepG2体外生长作用的影响，以期为九香虫水煎液在肝癌的临床应用上奠定理论基础，进一步为九香虫药用价值的深层次开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器

生物材料

人肝癌HepG2细胞株购于武汉普诺赛生命科技有限公司；九香虫成虫采集于贵州凯里市黄平县重安镇(E 107.80°，N 26.52°)。

试验试剂

含1%青霉素、链霉素的MEM培养基(武汉博士德生物工程有限公司)、胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT，上海碧云天生物技术有限公司)、二甲基亚砜(DMSO，美国Amresco公司)、Hoechst 33258染料(上海碧云天生物技术有限公司)、细胞自噬染色检测试剂盒-MDC法(北京索莱宝科技有限公司)。

试验仪器

0.22 μm针管式过滤器(美国Millipore公司)、超低温冰箱(浙江捷盛制冷科技有限公司)、二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)、生物安全柜(西班牙Telstar公司)、离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)、倒置相差显微镜(厦门麦克奥迪公司)、酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 试验方法

九香虫水煎液的制备

-80 ℃冰箱取出九香虫成虫，纯水冲洗两遍，烘干研磨成粉，取50 g虫粉加入100 mL纯水，浸泡30 min后于砂锅中煎煮60 min，小火浓缩至1 g/mL的九香虫水煎液。所得液体先后经纱布与滤纸过滤，6000×g、10 min离心2次，吸取上清于生物安全柜经0.22 μm滤头过滤除菌，用1.5 mL无菌离心管分装并于-20 ℃保存备用。

HepG2细胞的培养

用含10%胎牛血清与1%青霉素、链霉素的MEM培养基于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养HepG2细胞。

形态学观察及MTT法检测九香虫水煎液对肝癌HepG2细胞的影响

取对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化处理，接种于96孔培养板(1×10个/孔)。设置空白组(未接种细胞)、对照组(未加药物)以及试验组(10、20、30、40 mg/mL)共6个处理，每个处理设置5个复孔。待细胞铺满至孔底总面积的80%～90%后，弃掉培养液，空白组与对照组每孔加入100 μL MEM培养基，试验组分别加入不同九香虫水煎液浓度的培养液100 μL。继续培养24 h后，用倒置相差显微镜观察细胞的形态并拍照记录。拍照后弃培养液，每孔加入100 μL含10% MTT(5 g/L)的培养液，继续培养4 h后弃培养液，每孔加入100 μL DMSO，置于摇床上10 min，待蓝紫色结晶完全溶解后用酶标仪检测其在570 nm波长下的吸光值。试验重复3次。细胞活力(%)=(试验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。

九香虫水煎液对肝癌HepG2细胞自噬作用的影响

采用MDC法检测九香虫水煎液对HepG2细胞自噬的影响。细胞培养至对数生长期后，消化细胞接种于24孔板(2×10个/孔)，培养24 h，吸弃培养液，每孔按1.2.3加入相同浓度含九香虫水煎液的培养液500 μL，每个处理设置4个复孔。培养24 h，弃培养液，每孔加入300 μL 1×Wash buffer洗1次，加入10 μL MDC染液，37 ℃避光染色30 min，每孔加入300 μL 1×Wash buffer洗1次，倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。试验重复3次。

九香虫水煎液对肝癌HepG2细胞凋亡作用的影响

采用Hoechst 33258染色法检测九香虫水煎液对HepG2细胞凋亡的影响。待细胞生长至对数期后，细胞处理同1.2.4。加药培养24 h后，弃培养液，PBS洗3次，每孔加入300 μL甲醇固定30 min，弃甲醇，加入100 μL Hoechst 33258染液37 ℃避光染色15 min，PBS洗3次，倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。试验重复3次。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计学处理，结果以Mean±SEM表示，数据采用单因素方差分析，以<005为差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 形态学观察及MTT法检测九香虫水煎液对肝癌HepG2细胞的影响

不同浓度九香虫水煎液作用于HepG2细胞24 h后，对照组的细胞饱满圆润，轮廓清晰，贴壁性良好且细胞分布致密，无细胞碎片产生(图1-a)，而试验组(图1-b～e)则出现不同程度细胞皱缩，细胞碎片，细胞漂浮以及分布稀疏的现象，且随着浓度的增加，细胞皱缩、漂浮与细胞碎片数量增多，当浓度为40 mg/mL时几乎无贴壁细胞(图1-e)。

MTT结果显示，与对照组相比，九香虫水煎液对肝癌HepG2细胞增殖具有显著抑制作用。随着九香虫水煎液浓度的增加，细胞活力逐渐降低(<001)，表明九香虫水煎液具有显著抑制HepG2细胞增殖的作用，且呈浓度依赖性(图2)。九香虫水煎液作用于肝癌HepG2细胞24 h的半抑制浓度(IC)为26.23 mg/mL。

注：a-e分别为0、10、20、30、40 mg/mL，下同。图1 九香虫水煎液作用24 h对HepG2细胞形态的影响(100x)Fig.1 Effect of A.chinensis decoction on the morphology of HepG2 cells for 24 h (100x)

注：“*”表示P<0.05；“***”表示P<0.001。图2 九香虫水煎液作用24 h对HepG2细胞增殖的影响Fig.2 Effect of A.chinensis decoction on the proliferation of HepG2 cells for 24 h

2.2 九香虫水煎液对肝癌HepG2细胞自噬作用的影响

MDC染色结果显示，对照组细胞呈现均匀的黄绿色荧光，试验组则荧光强度增加，染色质浓缩，细胞核碎裂呈大小不一的点状，被染成致密的蓝绿色颗粒(图3)。随着九香虫水煎液浓度的增加，细胞数量减少，细胞核碎片增加，表明九香虫水煎液促进HepG2细胞自噬体形成。

图3 MDC法检测九香虫水煎液对HepG2细胞自噬的影响(200 x)Fig.3 Effect of A.chinensis decoction on the autophagy of HepG2 cells for 24 h detected by MDC method (200 x)

2.3 九香虫水煎液对肝癌HepG2细胞凋亡作用的影响

Hoechst 33258染色结果显示，对照组呈弥散均匀荧光(图4-a)，低浓度九香虫水煎液(图4-b、c)作用下细胞出现少量致密浓染，细胞形态相对完整；高浓度九香虫水煎液(图4-d、e)作用下细胞出现明显裂解，可见浓染致密的块状荧光。较对照组，试验组细胞染色质出现皱缩，细胞核染色增强，且随着浓度增加，细胞出现破碎。综上所述，九香虫水煎液能显著促进肝癌HepG2细胞的凋亡。s

图4 Hoechst 33258染色法检测九香虫水煎液对HepG2细胞凋亡的影响(100x)Fig.4 Effect of A.chinensis decoction on the apoptosis of HepG2 cells for 24 h detected by Hoechst 33258 staining method (100x)

3 结论与讨论

近年来，中医药在肿瘤的研究与运用逐渐受到重视。药用昆虫是指其虫体或产物具有治疗疾病的昆虫，是癌症治疗药物重要的组成部分。研究表明，斑蝥素、蜣螂毒素、蟑螂油等具有良好的抗癌活性；此外，蜜蜂、蚂蚁、胡蜂等膜翅目及部分蝶类昆虫体内也具有一定的抗癌活性物质。

九香虫作为一种传统药食两用昆虫，其传统中药复方多有用于抗癌，如九香岩痛宁(九香虫、鼠妇、元胡等)、癌痛克(金蝎、九香虫、土元等)、复方香龙散(九香虫、半夏、天龙等)，等。随着研究的不断深入，针对其单独抗癌作用也开展了诸多研究：如九香虫含药血清可诱导结肠癌细胞凋亡与凋亡相关因子的表达；九香虫血淋巴可显著抑制乳腺癌细胞体外增殖；九香虫三氯甲烷浸出物、水提液、乙醇粗提物等可通过阻滞细胞周期达到抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的增殖作用；并进一步从其体内纯化获得可显著抑制乳腺癌细胞的生长并诱导其凋亡的CHP蛋白。本研究则进一步明确了其对肝癌的抑制作用，也是九香虫单药水煎液模式对肝癌抑制作用的首次探索。本研究可为九香虫这一优良中药的深入系统应用提供参考。

其次，在已获得的九香虫多种组分中，水煎液的制作方式更加简单、快速。因而本文探讨了九香虫水煎液对肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡与自噬作用的影响。研究发现九香虫水煎液对肝癌细胞形态、细胞活力以及对细胞凋亡与自噬作用的影响与药物浓度呈显著正相关，说明九香虫水煎液具有显著抑制肝癌细胞体外生长的作用，且其肝癌HepG2细胞的IC为26.23 mg/mL。而田莹等发现，九香虫单药水煎液对乳腺癌MDA-MB-453、4T1细胞的IC分别为34 mg/mL、101 mg/mL，初步表明九香虫水煎液相较于乳腺癌MDA-MB-453、4T1细胞更有效果。另外，侯晓晖等利用九香虫乙醇粗提物对HepG2细胞的IC为582 μg/mL，相较于水煎液，其抗癌功效似乎更高，这可能与昆虫体内物质更多是醇溶性有关，乙醇可以更有效地萃取出九香虫体内的抗癌活性物质，其具体原因有待进一步研究。

此外，作为一种汤剂，水煎液具有易吸收、见效快以及随症加减的特点，在临床上具有良好的应用潜能，但水煎液中可溶解的药物成分多种多样，确切的药用成分及其对肝癌细胞抑制的具体分子机制仍不明确，也有待进一步研究。