西马特罗单克隆抗体的制备及胶体金快速检测卡的研发

刘颖沙 刘昭彤 曹亚岐 鲁瑶 岳彩洋 任若春

摘要：在国家粮食安全战略下，瘦肉精对人们健康造成很大威胁和冲击，目前市面上三联卡较多，对于盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇3种类型的瘦肉精研究较多。通过制备西马特罗单克隆抗体，优化胶体金标记及C、T线包被条件，制备能够快速检测猪肉中的西马特罗残留量的胶体金快速检测卡。结果表明，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1，分子量为148.5 ku，染色体数目为83～91 条，亲和常数为2.51×108 mol/L，最适pH值为7.5，最佳抗体标记量为6 μL/mL，最佳离心条件为8 000 r/min，T线最适包被浓度为1.0 mg/mL，C线包被浓度为0.5 mg/mL，对西马特罗的检测限（灵敏度）为10 ng/mL，与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗无交叉反应，特异性好。与酶联免疫吸附法的20份样品符合率良好，提示新研发的检测卡检测结果准确、灵敏度高，可在屠宰、养殖环节中完成猪肉西马特罗的现场检测。

关键词：西马特罗;单克隆抗体;瘦肉精;猪肉;快速检测卡

中图分类号：TS251.7   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）08-0182-05

瘦肉精，可提高动物瘦肉率，抑制肥肉生长[1-3]。对于瘦肉精的快速检测，科研工作研发快速检测卡、试剂盒等[4]，柳海燕等研制成功可用于现场检测二联速测纸条，可测定2项瘦肉精[5]。任清丹等对三联速测卡准确度优化提出改进措施，提供技术攻关[6]。喻俊磊等对动物源性食品中3项瘦肉精检测卡进行稳健性评价，采用评价测试法[7]。对于盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇3种类型的瘦肉精研究较多[8-11]。

西马特罗，能促进腺苷酸环化酶的合成，从而降低脂肪合成率，增加肌肉中的蛋白质[12]。其与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等10余种物质类似，俗称均为瘦肉精[13-14]。

在国家粮食安全的战略下，瘦肉精对人们的健康造成了很大的威胁和冲击，人们对于食品安全的意识逐步加强，科研工作者研发相关的检测方法。对于西马特罗，目前主要采用高效液相色譜法、气质联用法、液质联用法及新兴的酶联免疫法进行检测，但是对于更加快速的胶体金免疫层析法文献较少，因此本研究通过制备西马特罗单克隆抗体，优化胶体金标记以及CT线包被条件，制备能够快速检测猪肉中西马特罗残留量的胶体金快速检测卡。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2020—2021年在陕西杨凌进行研制西马特罗，猪肉组织样品、尿样，采自杨凌家香牧业有限公司。

西马标准品（≥98.0%）、盐酸克伦特罗-瘦肉精（98.8%）、沙丁胺醇标准品、妥布特罗标准品（99.8%），购自于坛墨质检标准物质中心;氯化金、柠檬酸三钠、抗坏血酸、鞣酸、Tween-20购自于西安企鹅生物科技有限公司;牛血清白蛋白（BSA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）购自于Sigma;Tris-HCl、羊抗兔 IgG、吸水纸、硝酸纤维素膜（NC膜）、结合垫、样品垫购自于上海捷宁生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯购自于杨凌三力化玻站。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器，购自于上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;划膜喷金仪购自于上海捷宁生物科技有限公司;可编程切条机，购自于上海捷宁生物科技有限公司;酶标仪，购自于美国伯乐公司;分析天平（万分之一），购自于梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司;分光光度计购，自于上海天普分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 西马特罗单克隆抗体制备

1.3.1.1 人工抗原的合成

西马特罗含有芳伯氨基，在强酸和冷却条件下芳伯氨基可以生成亲电的重氮盐，与蛋白中的给电子基团如酪氨酸、组氨酸残基反应，生成偶氮产物，制备成具有良好免疫原性。本研究采用西马特罗作为半抗原与载体蛋白（HSA、BSA、OVA等）偶联制备人工抗原[12]。

将西马特罗、载体蛋白及两者结合物配制成一定浓度的溶液，然后采用紫外分光光度计进行全波长扫描，经过计算分析得到人工抗原的结合比和浓度。

CIM-BSA、CIM-HSA、CIM-OVA结合比分别为10 ∶1、15 ∶1、7 ∶1，浓度分别5.5、6.8、3.2 mg/mL。

1.3.1.2 抗体的制备 （1）动物免疫。以CIM-BSA作为免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠。免疫时间一般需要间隔2周[15]。（2）单克隆抗体的制备。3免后第7天，采血清测效价，并分离阳性血清作对照[16]。

无菌操作取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合（比例数10 ∶1）。待细胞长至孔底的1/2～1/3时，采用已建立的ELISA方法筛选，最终得到3株稳定分泌单克隆抗体的细胞[17]，编号为1A-4H-5G、3B-5G-3H、6B-3D-3H。

1.3.2 标记条件优化

1.3.2.1 pH值条件优化

取6个1.5 mL的离心管，取1.0 mL胶体金溶液加入到离心管中，使每个离心管的pH值依次为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，摇匀，分别加入5 μL克伦特罗单克隆抗体，5～10 min 后再加入20%BSA溶液20 μL，放置5～10 min 后进行离心（8 000 r/min，10 min），弃上清，加入200 μL复溶液重悬，通过试纸条上T线的显色程度确定最佳pH值。

1.3.2.2 抗体标记量条件优化

取7个1.5 mL 离心管，取1.0 mL胶体金溶液加入到离心管中，将pH值调节至7.5，分别在每个离心管中加入1、3、5、10、20、40 μL西马特罗单克隆抗体，5～10 min后再加入20% BSA溶液20 μL，放置5～10 min后进行离心（8 000 r/min，10 min），弃上清，加入200 μL复溶液重悬。最佳标记量为最小标记量的1.2倍，最小标记量是抗体加入量最小的情况下检测线抑制效果佳。

1.3.2.3 离心力优化

取7个1.5 mL的离心管，取1.0 mL胶体金溶液加入到离心管中，将pH值调节至7.5，分别在每个离心管中加入12 μL西马特罗单克隆抗体，摇匀后，静止5～10 min，再加入20% BSA溶液20 μL，分别于3 000、5 000、8 000、12 000 r/min 离心8 min，离心完后看上清液是否澄清及探针是否容易重悬。

1.3.3 免疫层析垫点样浓度的确定

1.3.3.1 T线点样浓度的确定

将包被西马特罗抗原稀释成0.5、0.8、1.0 mg/mL，包被至NC膜上，根据T线阴性显色选择及检测限选择最适T线包被浓度。

1.3.3.2 C线点样浓度的确定

将二抗浓度稀释成0.5、1.0、1.5 mg/mL，包被至NC膜上，根据C线与T线阴性显色选择最适C线包被浓度。

1.3.4 胶体金快速检测西马特罗方法建立

1.3.4.1 标记胶体金

调整10 mL胶体金的pH值（稍高于最佳）和抗体浓度（最佳），低温搅拌充分反应0.5 h，添加10%的20 μL/mL BSA封闭 15 min，分装成10个1.5 mL小离心管，在最佳转速和时间条件下离心，使金标蛋白沉淀于底部，舍去上清液，将金标蛋白沉淀用胶体金复溶液溶解，调整铺金浓度，得到金标抗体溶液。在玻璃纤维素膜上进行喷涂，冷冻干燥后制作成为金标垫。

1.3.4.2 NC膜T线和C线的包被

西马特罗抗原稀释调整浓度为最佳显色浓度，并包被于NC膜的T线位置，即检测线（T线）;羊抗鼠IgG抗体稀释调整浓度为最佳显色浓度，并包被于NC膜的C线位置，即质控线（C线），形成免疫NC膜。再进行干燥处理，其中干燥温度为37 ℃，干燥时间为30～50 min，接着在封闭液中封闭，最后干燥即可。

1.3.4.3 样品垫

样品垫的前处理是需要玻璃纤维素膜浸没入封闭液进行封闭，再干燥即可。

1.3.4.4 吸水垫

吸水垫一般为普通的滤纸材料。

1.3.5 速测卡的组装

在底板上从左到右依次为样品垫、金标垫、NC膜以及吸水垫，最下层为NC膜，NC膜左侧1.0 mm上压金标垫，在NC膜右侧1.0 mm处上压吸水垫，在金标垫1.0 mm处上压样品垫，裁剪成3.5 mm宽的试纸条，装于塑料卡壳内，完成速测卡的组装。加样只需要吸取样品3滴（100 μL）加入样品孔中即可。

1.3.6 速测卡的性能检测

将100 μL待检样品逐滴加入速测卡的样品孔内，待10 min观察T线和C线的显色状态，记录现象和显色所需时间。

1.3.6.1 特异性试验

取西马特罗相似物盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和妥布特罗，分别用甲醇溶解，再用PBS缓冲液稀释成浓度为5、10、15、20、40、100 ng/mL 的溶液，采用空白溶液作为阴性对照，观察不同类似物在试纸条上的显色情况，采用速测卡进行检测，观察现象并记录數据。

1.3.6.2 灵敏性试验

取西马特罗标准品，先用甲醇溶解，配制成浓度为10 μg/mL的溶液;然后用PBS缓冲液将标准品稀释成不同浓度（5、10、15、20、40、100 ng/mL）的溶液，同时制备阴性对照。本测试卡为竞争抑制原理设计而成，随着浓度变大，T线显色变浅，C线变深。因此，视觉极限检测限（LOD）即为T线不显色而C线显色明显的浓度值。

1.3.6.3 准确度试验

采用胶体金法和ELISA法进行实际猪肉20份样品检测，将检测结果进行时间和效果比对，确定可行性和检测效果的精准性。

2 结果与分析

2.1 西马特罗单抗的制备以及效价检测结果分析

2.1.1 单克隆抗体的鉴定

经间接ELISA检测、染色体计数、SDS-PAGE电泳和ELISA单克隆抗体亚型检测试剂盒检测，表明单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1，分子量为148.5 ku，染色体数目为83～91条，亲和常数为2.51×108 L/mol。

2.1.2 抗体的交叉反应率

选择与西马特罗类似结构或功能的物质替代西马特罗标准溶液，绘制标准曲线计算IC50抑制浓度。结果发现，单克隆抗体对西马特罗的交叉反应为100%，对沙丁胺醇的交叉反应率为8%，对妥布特罗的交叉反应率为15%，对克仑特罗的交叉反应率为10%，对氯丙那林和特布他林的交叉反应分别为5%与4%，对莱克多巴胺、非诺特罗、喷布特罗、克仑巴胺、氧烯洛尔、异丙肾上腺素、肾上腺素和去甲肾上腺素的交叉反应均<0.1%。

选择与克伦特罗类似结构或功能的药物替代克伦特罗标准溶液，绘制其标准曲线，并计算IC50抑制浓度，计算交叉反应率，结果见表1。

2.2 标记条件优化结果

2.2.1 pH值条件优化结果

由图1可知，根据胶体金标记的原理，在pH值接近和稍高于蛋白的等电点时，胶体金蛋白吸附力最强;pH值过高或过低均不利于两者结合，当pH值为7.5时，T线显色最深，所以最适pH值为7.5。

2.2.2 抗体标记量条件优化结果 由表2可知，胶体金标记的2个关键环节是标记时pH值和最佳蛋白质标记量的确定。当抗体标记量在5 μL/mL时，阴性T线显色及检测限显色梯度最大;当抗体标记量为10 μL/mL时，阴性虽然显色更深，但是检测限抑制也会变差;当抗体标记量大于10 μL/mL时，阴性显色会变浅，并且检测限抑制也比较差，所以最佳抗体标记量为5 μL/mL的120%，即为6 μL/mL。

2.2.3 离心条件优化结果

当转速为3 000、5 000 r/min 时，上清液浑浊，说明转速不够，还有一部分胶体金没有离心下来。当转速为8 000、12 000 r/min 时，上清液澄清，但转速为 12 000 r/min 时探针不容易重悬，说明最佳转速为 8 000 r/min。

2.3 NC膜包被条件优化结果

2.3.1 T线

由T线包被浓度显色结果（表3）可知，随着包被抗原浓度的增加，T线显色变强，当抗原包被浓度为1.0 mg/mL时，T线阴性显色及检测限显色差异最大，所以T线最适包被浓度为 1.0 mg/mL。

2.3.2 C线

由C线包被浓度显色结果（表4）可知，随着二抗包被浓度的增加，C线显色变强，当二抗包被浓度为0.5 mg/mL时，C/T线显色基本一致，所以C线最适包被浓度为0.5 mg/mL。

2.4 卡片应用性检测

2.4.1 灵敏度检测

由图2和表5可知，西马特罗检测卡在5 ng/mL标准品时，T线显色略微有影，10 ng/mL 标准品时，T线不显色，说明西马特罗检测卡的灵敏度为10 ng/mL。

2.4.2 特异性检测

由图3和表6可知，添加不同浓度的盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗标准品，对西马特罗检测卡均未发生抑制作用，说明西马特罗检测卡与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗无交叉反应，特异性好。

2.4.3 準确度检测

由准确度检测结果（表7）可知， 研制的西马特罗检测卡与酶联免疫吸附法的20份样品符合率良好。

3 结论

在国家粮食安全的战略下，瘦肉精对人们健康造成了很大的威胁和冲击，市面上对于西马特罗的快速检测方法研究较少。本研究通过制备西马特罗单克隆抗体，探索发现最适pH值为7.5，最佳抗体标记量为6 μL/mL，最佳离心条件为8 000 r/min，得出T线最适包被浓度为1.0 mg/mL，C线包被浓度为0.5 mg/mL，制备能够快速检测猪肉中西马特罗残留量的胶体金快速检测卡，卡片灵敏度为 10 ng/mL，与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗无交叉反应，特异性好。与酶联免疫吸附法的20份样品符合率良好，说明新研发的检测卡检测结果准确、灵敏度高，具有应用价值，可在屠宰、养殖环节中完成猪肉西马特罗的现场检测。

参考文献：

[1]鲍兴智，何培政. 生猪屠宰环节“瘦肉精”检测方法及防控措施[J]. 宁夏农林科技，2020，61（11）：81-82.

[2]孟 宏.“瘦肉精”对食品安全的影响[J]. 黑龙江水产，2020，39（3）：16-17.

[3]杨金众. 食品中瘦肉精残留危害及其常用检测方法探讨[J]. 食品安全导刊，2020（3）：116.

[4]匡德春. 瘦肉精酶联免疫试剂盒的质量评价与使用[J]. 中国畜牧业，2017（21）：58..

[5]柳海燕，侯 景，曾学斌. 瘦肉精胶体金快速检测二联卡的研制[J]. 现代食品，2019（7）：133-136，142.

[6]任清丹，何东伟. 瘦肉精三联快速检测卡准确性的因素及对应措施[J]. 吉林畜牧兽医，2018，39（10）：53，55.

[7]喻俊磊，陈 沙，李雨露，等. 动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇快速检测产品的稳健性评价[J]. 江西农业学报，2019，31（11）：105-110.

[8]Solheim S A，Jessen S，Mrkeberg J，et al. Single-dose administration of clenbuterol is detectable in dried blood spots[J]. Drug Testing and Analysis，2020，12（9）：1366-1372.

[9]李 洋，辛伟娟，史丽新，等. 盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检验方法的简化与验证[J]. 食品安全导刊，2020（21）：118-121.

[10]沈轩昂，郝良文，张 燚，等. 基于金磁纳米粒子高灵敏定量检测盐酸克伦特罗的免疫层析新方法[J]. 食品与发酵工业，2020，46（22）：220-225，237.

[11]Shirato K，Tanihata J，Motohashi N，et al. β2-agonist clenbuterol induced changes in the distribution of white blood cells in rats[J]. Journal of Pharmacological Sciences，2007，104（2）：146-152.

[12]金 晶. ELISA法和胶体金免疫层析法检测猪尿样中的莱克多巴胺[D]. 南昌：南昌大学，2007

[13]吴小胜，臧勇军，李 斌，等. 西马特罗单克隆抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究[J]. 中国酿造，2020，39（9）：169-173

[14]熊 琳，萍 阎，高雅琴，等. 肉品生产中禁用药物西马特罗研究进展[J]. 食品安全质量检测学报，2017，8（1）：290-295.

[15]李君华，吴 萌，程 华，等. 西马特罗单克隆抗体的制备及免疫学特性鉴定[J]. 畜牧与兽医，2016，48（3）：123-126.

[16]职爱民，刘庆堂，李青梅，等. 西马特罗人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备[J]. 华北农学报，2010，25（4）：97-101.

[17]职爱民，李青梅，刘庆堂，等. 西马特罗杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体制备和鉴定[J]. 核农学报，2010，24（5）：1011-1014，1031.