形态标记在植物中的应用研究进展
2022-05-13马道承王凌晖梁机
马道承 王凌晖 梁机
摘要：形态标记作为一种易于识别的多态性形式，在遗传多样性分析、植物亲缘关系鉴定与良种选育等方面具有非常重要的作用，亦可作为其他标记方式的重要参考。随着植物种质资源与新品种选育等研究方法的逐渐成熟，对部分植物性状的描述趋于完善。但植物具有种类繁多、性状复杂等特点，大多数植物尚未出台成熟的表型性状描述规范及标准，且植物形态的建成不仅与基因型有关，环境因子及表观遗传效应对植物形态标记也有非常重要的影响。综述形态学标记的主要研究方法，从植物株型、根、茎、叶、花、果实、种子及解剖结构层面详细叙述可供形态标记的指标及标记方法，并对园林植物、蔬果类植物、用材林树种等国内外植物形态标记研究进展进行叙述，进而提出目前形态标记在实际应用中存在标记分析位点过少、性状难以横向对比、易受外部环境影响限制、稳定性稍差等问题，据此对形态标记的发展进行展望，以期为形态学标记的方法提升提供重要参考。
关键词：形态学标记;植物;表型性状;解剖结构;遗传多样性;种质资源;良种选育
中图分类号：S184 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2022）08-0055-08
遗传标记是一种对植株易于识别并可以稳定遗传的特殊遗传多态性形式的表示方法。广义的遗传标记包含形态学标记、细胞学标记、生化标记（同工酶标记）及分子标记，狭义的分子标记则指DNA分子标记。从经典遗传学进化到现代遗传学时，对遗传多样性的表述也逐渐从等位基因的变异转换为DNA或基因组中任何位置的相对差异[1]。形态标记不仅指肉眼或仪器可测量的植物特征，也可指植物不同器官的解剖学结构表现出的各类遗传多样性参数，如描述性状数据分布型、数据特征、表型方差及分化系数等[2]。故形态学标记即为植株表型的鉴定，包括植物外部形态及营养器官（如茎、叶、株型等）、生殖器官（如花、果实、种子等）等外部形态的表现及部分器官内部解剖结构的相关表现及性状（如根系、茎、叶等组织、器官的解剖结构）。植株表型性状可作为植物遗传多样性差异的衡量标准，反映出植株间表型和基因型的差异，进而反映植物遗传多样性的差异，可为接下来的性状选择、引种与品种定向选育提供方向。此外，可通过不同表型的指标及表型变异丰富度反映出植物遗传多样性及不同种质间的遗传关系[3]。
1 形态学标记研究方法及国内外研究进展
1.1 形态学标记研究方法
对植物而言，其性状可分为数量性状及质量性状2类，而就数量性状而言，甚至可以细分为二元性状、定性多态性状和数量多态性状3类，但各类性状描述均存在一定的不足。二元性状代表此性状在不同植株中是否存在，仅将“有”和“无”作为评判标准，虽易于记录，但因植物种类繁多、性状复杂，故难以对大多数性状进行如此简单定义;定性多态性状常用于描述植株的数量性状，具有易于采集、效率高、易区分统计等特点，目前已被应用于多种植物之中;数量多态性状则主要描述受环境影响多呈现连续变化，在可靠性及重复性方面较欠缺[4-5]。用于进行标记及分类的性状数量并非越多越好，而应根据植株特点及解剖结构的差异选择与该种植物分类密切相关、明显且易于区分的形态形状指标进行观察记录[6]。
目前针对部分植物已出现比较成熟的形态描述体系，甚至已出现相关标准。在中国知网（https：//www.cnki.net）中输入关键词“种质资源描述规范”，可检索出各类标准56条，其中包括木薯、芒果、椰子等常见经济作物及红掌、非洲菊等园林观赏植物;以“种质资源描述”为关键词时，“标准”一栏检索结果多达123条。部分植物的表型描述目前较为详尽。如针对甘薯（Dioscorea esculenta）出现了书籍[7]和行业标准（NY/T 1320—2007 《農作物种质资源鉴定技术规程 甘薯》和 NY/T 2176—2012《农作物优异种质资源评价规范 甘薯》）;南瓜（Cucurbita moschata）出现了《南瓜种质资源描述规范和数据标准》[8]，黄瓜（Cucumis sativus L.）[9]、豌豆[10]等植物亦已出现关于其种质资源形态描述的书籍，园林植物中尤甚，《中国菊花图谱》[11]、《中国梅花品种图志》[12]、《中国茶花图谱》[13]、《中国芍药》[14]等书籍中对此类花卉植物常见品种进行了介绍。且早在2005—2008年，对于部分果类植物（葡萄、樱桃类植物等）已出现对其种质资源描述性状的探讨[15-16]。但目前多数种类植物（尤其花卉）种类繁多，且大多数性状在肉眼看来非常接近，在不具备相关基础知识及认知的情况下，几乎无法直接辨认并进行标记。可见，对于常见植物表型性状的描述正在逐渐完善并呈现体系化趋势。
对于尚未出台表型性状描述规范及标准的植物，则可根据该种植物典型的器官特点进行描述。从各类形态标记研究论文中不难看出，常见用于植物遗传多样性形态学标记的性状如下。
（1）株型。对株型的性状描述常见于林木中，以株高（树高）、胸径、冠幅、枝下高、干型等指标较为常见，部分指标（如冠幅、分枝密度等）亦可用于园林观赏植物分析[17-18]。
（2）根、茎性状。对根、茎性状的描述常见于出现地下部分变态或茎形态特别的植物。如西洋参中依据根长变异分为长枝型、短枝型;依据根型变异分为长形型、短粗型、枝杈型、疙瘩型[19];对茎的描述常见于根状茎形状[20]、最长蔓长[21]、主干分杈习性、主干通直度、侧枝密度、侧枝粗细、侧枝长度、侧枝分枝角、绿色小枝粗细[22]、幼茎颜色、成熟主茎内外皮色、块根缢痕[23]等指标;对竹类植物还可对竹秆高、秆径、秆壁率、气生根节数、节间中部竹壁厚度、节间长度、节间扁圆率和斜交率进行标记[24]。
（3）叶性状。作为植物个体中数量最多的营养器官，叶常用于植物遗传表型分析。植物常见叶表型指标有叶长（LL）、最大叶宽（LWi）等，此外，亦有叶片中宽（1/2LW）、叶形指数（LSI）、叶宽与叶长 1/2 处宽度之比（WWR）、叶长与叶长1/2处宽度之比（LWR）、叶柄长（LSL）、叶片厚度（LT）、单叶面积（LA）、单叶干质量（LWe）[25]、叶尖形状、叶基形状、叶缘锯齿性状及深度、是否存在托叶[26]、湿质量[27]、叶周长、绒毛密度[28]等指标。部分植物（如菊等）甚至对叶性状做出更为细致的规定，如叶身长宽比（叶身长/叶身宽）、叶柄叶长比（叶柄长/全叶长）、顶裂片长宽比（裂片长度/裂片宽度）等[29]。品种叶片的结构数值具有稳定性，可充分展示植物不同品种的差异并分析种间亲缘关系[30]。除此之外，还包括叶上表面颜色、叶着生方式、叶柄有无及颜色等方面[31]。部分植物中将叶形进行细化。如西洋参中依照叶宽长比可分为长叶型（宽长比小于0.45）、普通叶型（宽长比为0.45～0.60）及圆叶型（宽长比大于0.60），按照叶展角度分为直立型（叶展角度<40°）、平展型（叶展角度>70°）等[19]。对于叶片存在锯齿的植物（如葡萄等），叶齿长度、宽度、叶柄洼深度、成熟叶片叶齿形状、主脉颜色等亦可作为表型标记相关指标[32]。
（4）花性状。目前，针对植物花性状的描述主要出现于园林植物中。因多数园林植物目前性状变异丰富，故而多种园林植物的DUS测试[即特异性（distinctness）、一致性（uniformity）和稳定性（stability）的栽培鉴定]中对其性状做出了较详细的描述。以菊花为例，根据中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2228—2012《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 菊花》中的相关规定，对菊花植株类型（如非丛生型、丛生型）与生长习性（如直立、半直立、平展等状态）、叶柄形态（如向上、平伸、向下）、叶裂片与叶片基部形态（如锐角、钝角、圆等）、叶片锯齿形态、花序一级侧枝与茎夹角、头状花序类型、花心类型、舌状小花数量及颜色等性状均进行了描述，且对各类性状测定的时期也进行了说明与规定，甚至细化到舌状小花质地及龙骨数量等。此外，对菊花花型及花色的相关分类对比，可分别按照1982年菊花品种分类学术讨论会及英国皇家园艺协会比色卡（RHSCC）进行比对，结合目测统计进行描述[33]。故对菊花形态性状的描述，除常见的5个瓣形（平瓣、匙瓣、管瓣、桂瓣、畸瓣）、30个花型（叠球型、翻卷型、荷花型、宽带型、平盘型等）、七大色系（白色、橙色、黄色、红色、绿色、紫色和粉色）及双色间色的花色描述[33]外，已几近形成独立系统。菊花的形态标记不仅局限于花形态，对茎、叶等器官亦可进行标记及统计分析[34]，即对花卉的瓣形、花型、花色等性状进行了详细规定。此外，对其他植物花性状的描述可见于花直径、花瓣长度、花瓣宽度、花序类型、花瓣形状、花着生方式、单花数量[31]、佛焰苞宽度、佛焰苞长度、小穗数每花序、长度最长的小穗[35]、花柄孔数[36]等指标。由此可加，花器官因结构复杂，在形态标记的环节反映指标也比较多。
（5）果实、种子性状。对植物果实及种子性状的描述常见于对其本身及附属部分的描述。如果核长、果核宽、种子长、种子宽、果核皮厚、种子百粒质量、果核百粒质量[37]、荚果长、荚果宽、荚果数量、荚果花梗长度、荚果梗长[38]、连续卷须数、花梗长度、果实长度、种子存在量、种子数量[32]、种翅长（WL）、种翅宽（WW）、种翅长宽比（WR）[39]、果形系数（果长/果径）、种形系数（种长/种径）[40]、包刺密度、包刺长、果形指数（果实纵径/横径）、果皮质量、果皮厚、果轴纵径、果轴横径、果轴质量、果包总数、果包总质量、果肉质量、果包厚、种子总数、种子纵径横径比、可食率（果包总质量/单果质量×100%）、单果包质量、单籽质量[41]、小穗数、小穗密度、护颖长短[42]等。
（6）解剖结构性状。对植物的解剖可见于植物体各类器官。叶片的解剖结构常用细胞层数、叶片紧实度、叶片结构疏松度、上下表皮角质层厚度（TUC、TLC）、上下表皮厚度（TU、TL）、柵栏组织厚度（TP）、海绵组织厚度（TS）、叶片厚度（LT）、400 μm 范围内第1层栅栏组织细胞数量（CA）、栅栏组织层数（LP）、栅海比（P/S）、栅叶比（P/L）等指标进行衡量[43-44]。但对于部分植物（如松类植物等），因其叶片结构的特殊性，会有相对较适应的解剖结构指标，如气孔数、树脂道总数、外生型树脂道数、中生型树脂道数、维管束鞘面积、维管束鞘最大直径、两维管束间最小距离、树脂道平均面积、平均气孔间距离、外生型树脂道比例、中生型树脂道比例、维管束鞘占横截面积比例、两维管束间最小距离与维管束鞘最大直径比、叶厚宽比、树脂道总面积占横截面积比等指标[45]。
在植物上述表型指标中，生殖器官（花、果实、种子）相对于营养器官在不断的演化过程中遗传变异是最稳定的，故最适宜进行遗传标记[46]。在对植物进行形态学标记时，必须注意选择相同的植株本底进行分析，即在相同季节、生长阶段、部位、方位对表型指标进行测量并进一步分析。
1.2 形态学标记国内外研究动态
对植物进行形态学标记始于孟德尔对豌豆进行的杂交试验，通过对豌豆杂交后代植株花色性状进行对比、记录，即可得到杂交后代的遗传规律，此为历史上首次对植物的遗传多样性进行研究的记载。通过对豌豆杂交后代的表型进行记录及分析，得出不同的分离比，而后提出基因分离定律及基因独立分配（自由组合）定律[47]。而后，对于豌豆杂交后种子的性状等形态标记研究随之深入。形态学标记随着植物及时代的进化、演变而不断发展，目前其亦被广泛应用在各类农作物、经济类植物（如核桃[48]、云南小麦[49]、高羊茅[50]、梨果仙人掌[51]、橄榄[52]等）、药食两用作物（如罗勒[53]等）、林木（如扁桃[54]等）、药用植物（如广东紫珠[55]、艾蒿[56]、香桃木[57]、洋甘草[58]）、蔬果类植物（如南瓜[59]、石刁柏[60]、辣木[61]、葱属植物[62]等）等种类的植物之中，人们通过肉眼或部分测量工具对植株的对应器官进行观察、识别及测量等工作即可得到此植株形态上的差异。
1.2.1 表型性状研究 戴希刚等通过菊花12个数量性状（包括株高、茎粗、分枝长度、节间长度、花枝数等）对15 个多头切花菊品种进行遗传多样性分析，后通过遗传距离进行非加权组平均法（UPGMA）聚类分析，将其分为五大类[34]，基于菊花表型描述亦可对药用菊花进行分类[63];宋雪彬通过对不同菊花品种的叶表型及舌状花性状进行统计分析，引入了菊花舌状花形态关键性状——花冠筒基部合生程度（CTMD）并进行数量化分级，最终构建3类9型菊花舌状花分类体系，并通过24个叶片形态性状及13个叶形结构参数性状，将436个菊花品种分为16类[64];Ye等使用34个数量及质量性状对百日菊（Zinnia elegans）进行形态学标记，并与随机引物扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）和简单重复序列区间（inter-simple sequence repeat，ISSR）分子标记结果进行比较，可将20个自交品种分为5类[65];Hashemifar等通过叶、花序、种子等器官的性状对园林观赏植物分药花（Perovskia abrotanoides）进行表型鉴定，最终依据地理位置将68个种群分为3大类（北部和东北部，东南部，中部、北部和东北部）[66];吴蕊等选择株高、叶表面颜色、叶柄颜色、叶尖类型、小叶形状及叶顶端裂深6项指标作为形态指标并赋予相对应的权重，对栽培牡丹秋发 1 号（Paeonia suffruticosa Qiufa 1）与野生紫牡丹（Paeonia delavayi Franch.）杂交后的F1代植株进行鉴定，将其分为偏父型、偏母型和中间型3种类型，结合ISSR分子标记结果对牡丹杂交后代进行早期鉴定[67];罗玉兰等对红刺玫和月季进行杂交，并将其后代与亲本之间进行形态对比，结合简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）分子标记相关结果鉴定亲本与F1后代之间的亲缘关系并选择需要的表型性状[68];此外，形态学标记还被广泛应用于牡丹[69]、蜡梅[70-71]等园林植物中。程千钉等对3种百合杂交后代进行苗期形态分析并进行RAPD 分子标记鉴定，结果表明，其中2种杂交后代形态偏向野生型父本[72]，这可能是由于野生种相对栽培种具有更强的遗传传递能力导致的[73];徐世松等基于形态学标记对红掌（Anthurium andraeanum Linden.）进行了遗传多样性分析，将32个红掌品种分为4个小类群和1个大类群[74]。此外，对于植物表型标记的研究还存在于甘薯[75]、蜡梅[76]、珍珠黄杨[77]等植物中。
综上所述，表型标记除了可以对植物不同品种间进行划分、鉴定及聚类分析外，亦可对杂交后代与亲本之间的亲缘关系进行对比，甚至对植物起源的探究起到重要的作用[78]，在遗传多样性及亲缘关系研究中具有非常重要的作用。
1.2.2 解剖结构研究 植物解剖结构与其对环境的适应性、抗逆性密切相关，可作为植物表型标记及适应性评价的一项重要内容[79-80]。对于植物解剖结构方面亦有较多研究。王飞权等使用17项叶片解剖结构性状对70 份武夷名丛的茶树种质进行遗传鉴定，将所有种质资源划分为 3 个类群，为后期种质资源良种选育提供了理论基础[44];罗涛对重庆地区野生春兰（Cymbidium goeringii）根部进行解剖并与叶形态特征进行对比，挖掘其遗传特性及形态学差异[81];金洪采用形态学标记、解剖结构分析与分子标记相结合的方法，将我国20个结缕草居群分为8类[82];邓传良通过对11种石蒜属观赏植物叶解剖结构进行观察，并结合叶表型指标，探究石蒜属植物系统分类的关系[83];李亚男通过研究110个来源的狗牙根居群解剖结构特征，并依据解剖学机制筛选抗旱性指标并据此筛选出2份抗寒性较强的狗牙根种质（HNBS0801、HNLG0801）[84];徐静静通过对比15个杜鹃品种叶片解剖结构之间的差异并对不同指标进行聚类分析，最终将15个杜鹃品种聚为不同的分类[85];Litkowiec等研究地中海地区及欧洲中部地区不同类群冷杉针叶表型及解剖结构，揭示其与地理环境之间的关系，并推断其遗传特征[86]。此外，对于植物解剖结构与遗传关系之间的研究还可见于紫椴及部分药用植物中[87-88]。
2 形态学标记研究方法不足之处
尽管形态学标记具有直观、快速、简便的特点，在不进行更深层次的检测时可作为园林植物品种分类最直观的方法[89]，但目前单纯的形态学标记依旧存在以下不足之处。
2.1 存在可供标记、分析的位点过少
随着越来越多的植物性状及形态的逐渐出现，植物基本性状已不能采用简单的形式进行标记及区分，且这些形态、性状也由多种基因进行共同控制，在部分园艺变种非常多的植物中更甚，如菊花、梅花、茶花、芍药、三色堇等园艺变种繁多的植物，此类植物性状均有相关的规定进行了充分的介绍，故难以通过单纯的形态辨认方式区分不同的变异形式。此外，部分植物相关物种由于外观、形态特征和颜色的相似性，可能存在物种间的混淆。如由于姜黄属几种植物外观和颜色的相似性，其形态特征可导致几个相关的物种出现识别的混淆及鉴定错误[20]。
2.2 部分性状不通用，难以进行横向对比
在部分园艺变种较多的植物种类中，部分性状描述只适用于特定种类的植物品种。例如，在中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2228—2012《植物新品種特异性、一致性和稳定性测试指南 菊花》的描述中，对花心小花针状、管状、漏斗状、管状（上端增粗）及花瓣状的描述仅限于托桂型品种;对花枝形态中圆锥形、拱圆顶形、圆柱形、伞型、平顶伞型的描述仅限于分丛生型多头品种;对顶生头状花序着生姿态中上冲、斜上冲、水平、下垂的描述仅限于非丛生型品种;除此之外，对花托纵切面、舌状小花纵向形态等性状的描述也存在特定品种的规定。若植物品种较多且差异较大时，难以仅通过表型完成对植物的分类及鉴定。
2.3 植株形态易受到外部环境影响，制约因素多
植物表现型与其本身基因型及外部环境的共同作用有关，形态的建成（尤其是一些数量性状）受到环境等外部条件的影响，无法反映植株本身全部的遗传差异，即存在表型=基因型+环境（P=G+E）的关系，且数量性状的统计通常在一个时期，难以贯穿植物整个生长发育过程，故很难完全对植物基因型进行充分反映[46]。此外，植物的一些数量性状难以摆脱环境的影响，表观遗传变异在植物表型形成的环节具有重要的影响作用。基因组DNA（基因型）+环境因素+表观遗传变异+母系遗传效应=表现型。如王沫竹的研究表明，香菇草表观遗传多样性较高，与种群内及种群间的变异存在一定的关联，而表型变异则未占主导地位，且水淹、光照皆对其形态建成起到一定的影响作用[90];部分植物（如虎杖等）表观遗传水平大于遗传水平，且二者互相独立[91];He等利用甲基化敏感性标记（methylation-sensitive amplified polymorphism，MSAP）技术对全球各地收集的60份地方种质资源蓖麻的表观遗传多样性进行了研究，结果表明，表观遗传多样性在群体水平上表现为中等变异，而不同种源之间没有明显的地理结构[92];Mastan等利用扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术与甲基化敏感扩增片段长度多态性（methylation-sensitive AFLP，MS-AFLP）技术对麻疯树进行标记，结果表明，不同种源麻疯树表观遗传变异大于遗传变异，遗传差异较小的基因型可能具有较高的表观遗传差异[93];DNA甲基化、RNA甲基化、组蛋白修饰、小分子RNA（microRNA）等途径可通过影响转录过程、染色质重塑等方面从而达到不通过改变DNA序列而影响植株表型的效果[94-96]。这是目前表型标记中尚待深入研究的部分。
2.4 遗传稳定性不一致，可靠性稍低
在植物中，生殖器官（花、果实、种子）的遗传变异最稳定，但营养器官（如叶等）在同一植株中随着生部位、发育阶段、生长环境等不同存在较大形态差异。在植物种间杂交频繁、关系复杂的情况下，仅通过表型分析易出现以偏概全、混淆等现象，使种间关系模糊难以区分。故仅使用表型性状进行分析时必须注意选择相同季节、部位、方位、发育阶段的植株进行表型性状标记及分析[97]。
此外，表型标记与分子标记得出的遗传多样性分析结果因物种不同存在较大不确定因素。Zafar-Pashanezhad等研究表明，植物Eruca sativa L.基因型的地理起源与分子分类结果相似程度很高[98];关锰等对陕西、河南、浙江3省的35 份山茱萸种质资源进行表型及ISSR分子标记遗传多样性分析，结果表明，各种源形态特征与地理分布、分子标记结果具有一定的相关性[40];蒋向辉等对7个不同来源金银花品种进行形态标记与分子标记时，二者研究结果类似[99]。但在多数表型标记与分子标记进行对比的研究中，基于表型标记得出的种质资源、物种聚类结果与分子标记结果之间存在一定的不同。Rahimi等对伞形科一种名为Ducrosia anethifolia Boiss.的植物进行表型标记及分子标记分析时发现，形态分析结果与分子分析结果并不完全对应[100];Kadri等的研究表明，椰枣（Phoenix dactylifera L.）可能由于不同地区之间植株存在相互交配问题，种质资源不能完全按照地理来源进行分类[35];唐丽等对湖南地区13个南天竹种源的南天竹研究表明，其形态标记和 ISSR标记聚类结果之间的相关性不高，相关系数仅为 0.213[101];文亚峰等对人心果形态及分子标记的结果关联性亦不高[102];魏仕伟等对叶用莴苣进行形态标记及SSR分子标记的结果表明，27份材料形态标记仅将材料分为2组，而分子标记可分为4组，二者分类结果截然不同[103]。此类结论还出现在黑麦草[104]、石竹类植物[石竹（Dianthus chinensis）、须苞石竹（D. barbatus）和瞿麦（D. superbus）][105]等植物中。这很可能是由于不同种源、不同种类的植物在不同生长环境中受到环境因素的长期影响，进而出现表观遗传变异。此外，标记结果的一致性也与物种进化背景、生态习性等因素存在相关关系，标记方法本身的准确度及原理对结果也存在较大影响。
基于以上的局限与植物物种不断的发展与进化，目前形态学标记仅作为辅助或遗传标记中的一部分使用。针对植株表型与表观遗传变异、种群变异之间关系的研究少之又少。
3 植物形态学标记的研究展望
形态学标记目前在林木遗传育种及园林植物遗传育种学科中依旧具有重要作用，其简洁、直观的特点是其他任何一种遗传标记方法所不具备的。基于目前形态学标记中依旧存在的诸多问题，可对各个种类的植物建立相应的性狀描述标准，在性状的描述规范上更进一步，此外，可针对不同种类植物建立相应的形态学标记时期及方法，探究植物不同生长发育时期下形态的差异。目前有文献表明，外界环境对植物体造成的长期影响可形成一定的表观遗传效应，其可能发生于植物生长发育的任何阶段。表观遗传效应与遗传物质表达所造成植物性状的差异的相互关系及内在机制，目前仍未明确，有待进一步研究。此外，应更注重表型标记、解剖结构标记以及细胞学标记、生化标记及分子标记之间的关联，为林木或园林植物选育提供重要参考。
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