丹酚酸A抑制血小板及中性粒细胞活化作用

杨文杰，王洪颖，马璐璐，方乐玉，李春晓，张璐莎，张丽媛，王倩怡，孙 伟，冷雨泽，薛岳进，李梦瑶，陈 璐，王 虹

(1. 天津中医药大学中西医结合学院, 天津 301617；2. 中国人民解放军联勤保障部队天津康复疗养中心, 天津 300141；3.天津中医药大学组分中药国家重点实验室, 天津 301617)

心血管疾病是由高脂血症、动脉粥样硬化等所导致，涉及心脏、动脉、毛细血管和静脉的血液循环系统疾病，根据中国心血管危险因素研究显示[1]，我国心血管疾病患病率和死亡率仍处于快速增长阶段，心血管病死亡率在居民死亡构成中居首位。心肌损伤后，血小板功能改变，中性粒细胞活化，内皮黏附分子上调，活化的血小板和中性粒细胞黏附到内皮表面，在梗死区形成中性粒细胞-血小板聚集体[2]，使梗死面积进一步扩大，因此，抑制血小板和中性粒细胞活化是预防和治疗心血管疾病的重要环节。目前临床上常用的治疗药物作用靶点单一，选择性低，在发挥抗血小板或抗炎作用的同时常伴有严重出血、胃肠道溃疡等风险，发现并深入研究安全有效的抗血小板和抗炎药物尤为重要，同时寻求新的靶点成为关注方向。

丹参为活血化瘀药，广泛应用于缺血性心血管疾病的治疗，丹酚酸A(salvianolic acid A，SAA)是丹参水溶性成分中含量丰富的物质之一，也是最强的抗氧化酚酸之一[3]，对血栓、炎症、癌症等有治疗作用[4]。但是SAA是否通过影响血小板及中性粒细胞活化来抑制心肌缺血疾病还有待进一步研究。本研究通过测定SAA对体内外血小板和中性粒的活化来探讨SAA治疗心血管疾病的作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物SPF 级健康 C57BL/6 45小鼠，♀♂各半，6～8周龄，体质量 (20±2) g，均购自北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0003，饲养与SPF级动物实验室。所有实验均经天津中医药大学临床药理研究所动物实验伦理审查委员会批准。实验中涉及的方法均根据动物实验相关指南和法规进行。

1.2 药品与试剂替罗非班(tirfiban，批号WKQ-17915)购自四川省维克奇生物科技有限公司；丹酚酸A(salvianolic acid A， SAA，批号DST180201-008)购自成都德思特生物技术有限公司；二磷酸腺苷二钠盐(adenosine-5′-diphosphate disodium salt， ADP，批号SLBN0134V)购自Sigma公司；CD45 antibody(货号：Ab10558)购自abcam公司；CD42c antibody(货号：YT6028)购自Immunoway公司；APC anti-mouse/rat CD62p antibody(货号：148303)购自Biolegend公司；PVDF膜(货号：HVHP01300)购自密理博有限公司；BCA 试剂盒(货号：PC0020)购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 仪器小动物呼吸机(Harvard Inspira公司，美国)，体视显微镜(Leica公司，德国)，高分辨率超声仪(Visual Sonics公司，加拿大)，流式细胞仪(BD 公司，美国)，Flex Station 3酶标仪(Molecular Device 公司，美国)，倒置荧光显微镜(Nikon公司，日本)

1.4 小鼠MI模型的建立建立小鼠MI模型，小鼠麻醉、固定、气管插管呼吸机正压通气，潮气量为1 mL，将呼吸频率调至100次·min-1，呼吸比2∶1。开胸暴露心脏，以眼科缝线沿左心耳下缘2 mm穿过冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)，结扎引起LAD闭塞，Sham组仅穿缝线但不结扎。建模成功后，逐层缝合胸腔并排出胸腔内气体。小鼠清醒后随后常规饲养。

1.5 分组及给药随机将C57BL/6小鼠分为如下组(每组9只)：正常对照组(生理盐水)、MI模型组、SAA低剂量组(5 mg·kg-1)、SAA高剂量组(10 mg·kg-1)、Tirofiban组(0.87 mg·kg-1)。适应性喂养7 d后进行MI模型的建立及术后尾静脉注射给药，MI+SAA 组给予SAA尾静脉注射(5 mg·kg-1或10 mg·kg-1，每天1次)，MI+Tirofiban组给予Tirofiban尾静脉注射(0.87 mg·kg-1)，连续3 d；MI组以同等量的溶媒(生理盐水)注射。正常对照(sham)组尾静脉灌注等量溶媒(生理盐水)，连续3 d。

1.6 心功能评价持续吸入异氟烷麻醉小鼠，仰卧固定至37 ℃恒温板。小鼠四肢与电极相连监测心率。胸部脱毛并涂抹超声波耦合剂，分别在短轴和在四腔面检测小鼠心脏的舒缩和血流变化。选取连续5个心动周期测量计算左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短轴缩短率(fractional shortening，FS)、收缩末期左室前壁厚度(systolic left ventricular anterior wall，LVAWs)、舒张期左室前壁厚度(diastolic left ventricular anterior wall，LVAWd) 、收缩末期左室后壁厚度(systolic left ventricular posterior wall，LVPWs) 、舒张期左室后壁厚度(diastolic left ventricular posterior wall，LVP-Wd)、左室舒张早期最大血流/二尖瓣心房收缩期最大血流(ratio of E /A)，数据取平均值。

1.7 心肌组织HE染色将处死后小鼠的心脏剪取左心室，含室间隔部分，用10%的甲醛浸泡固定，沿左室长轴的中点行组织切片，其厚度保持在4 μm左右。用去离子水清洗切片组织后，苏木精染色3～5 min，再次用去离子水清洗后，置入含1% HCl的无水乙醇中固定，之后再用伊红染色1～4 min，去离子水清洗干净，无水乙醇固定后石蜡包埋，置入普通显微镜的40×物镜镜头下观察。

1.8 免疫组化检测小鼠心脏中CD42c、CD45、Ly6G以及C3aR的表达小鼠心脏组织石蜡切片，脱蜡水化，封闭，加抗原修复液进行冷修复，一抗，即CD42c、CD45、Ly6G、C3aR(1 ∶100)抗体，4 ℃孵育过夜，次日室温放置30 min后，先滴加反应增强液室温反应10 min，后滴加二抗，室温反应20 min，DAB显色5～8 min，苏木精复染20 s，脱水，封片显微镜观察CD42c、CD45、Ly6G、C3aR的表达情况。

1.9 ELISA检测血小板中中性粒细胞NE、MPO、MMP9、LF的释放根据ELISA 说明书进行，在NE、MPO、MMP9、LF 细胞因子检测板中加入样本或对应的标准品，严格按照试剂盒说明书操作，加检测抗体孵育，洗板，加酶孵育，洗板，加入显色剂显色反应15 min后，加终止液使反应终止，立即在酶标仪设置参考波长610～630 nm，检测波长450 nm测出各孔吸光度值，用ELISACALC软件绘制标准曲线并计算出中性粒细胞NE、MPO、MMP9、LF 细胞因子的水平。

1.10 Western blot法检测相关蛋白的表达取分离后的血小板悬液，分别加入生理盐水、Tirofiban以及不同浓度的SAA于37 ℃，孵育20 min，将空白对照组，Tirofiban、SAA组分别加入20 μmol·L-1ADP于37 ℃，孵育10 min，3 000 r·min-1离心10 min，去除上清，沉淀按照组织裂解液 ∶PMSF ∶磷酸酶抑制=100 ∶1 ∶1比例加入配置好的裂解液，冰上裂解 1 h。4 ℃，15 000 r·min-1离心 20 min，收集上清，BCA 蛋白定量。电泳，用PVDF膜进行转膜；TPBS配置脱脂牛奶(5%)在37 ℃温箱中孵育2 h；洗膜，孵育一抗，即兔抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、VSAP、p-VASP(1 ∶1 000)抗体，4 ℃结合12 h以上；洗膜；37 ℃孵育二抗2 h；洗膜显影。

1.11 免疫荧光法检测炎性趋化因子CXCL1、CXCL2的释放将处死后小鼠的心脏剪取左心室，含室间隔部分，切片脱蜡后微波处理15 min，PBS冲洗3次×3 min后兔血清封闭切片，加入一抗CXCL1(1 ∶50)或CXCL2(1 ∶50)抗体，4 ℃ 孵育过夜。次日取出，PBST冲洗3次×3 min，和Cy3标记的荧光二抗共孵育1 h，滴加 DAPI 复染，封片。Nikon倒置荧光显微镜的40×物镜镜头下观察，PS软件分析计算红绿蓝荧光比值。

1.12 流式细胞术检测血小板CD62p的荧光强度分别于小鼠MI术前、术后3 d，采集经肝素钠抗凝的外周血，提取分离血小板，各组分别加入生理盐水、Tirofiban、SAA不同浓度于37 ℃，孵育20 min，将空白对照组加生理盐水，将阳性药和丹酚酸A组加入20 μmol·L-1ADP于37 ℃，孵育10 min，每管加入CD62p-APC 各1 μL，再加入10 μL处理过的血小板悬液及89 μL台式缓冲液，4 ℃避光孵育30 min，加入500 μL 1% 多聚甲醛，充分混匀，于1 h内上机检测，用FACS流式细胞仪检测CD62p表达的细胞数，每份标本检测10万个细胞，以表达CD62p细胞占总细胞的比例表示外周血中血小板活化的数量，用 Cell Quest 软件分析并记录外周血中血小板活化的比例。

2 结果

2.1 SAA对MI小鼠心功能的影响如Tab 1超声结果所示，与Sham相比，MI模型组(Saline)LVEF、LVFS明显降低(P<0.05)，表明心肌梗死模型造模成功。与MI模型组(Saline)比，Tirofiban组和SAA高剂量组能够提高左心室的舒张收缩功能，射血分数、短轴缩短率均明显高于模型组(P<0.05)，其差异具有统计学意义。表明SAA能够改善MI小鼠的心功能。

2.2 SAA对MI小鼠心脏组织形态变化的影响Fig 1的HE染色中Sham组小鼠的心肌组织和细胞结构完整清晰；Saline组小鼠心肌组织以肉芽和瘢痕组织为主，心肌组织染色较浅，呈疏松化。和Saline组相比，SAA组心肌组织和细胞结构较为完整，形态学清晰；Tirfiban组小鼠心肌组织形态和Sham组相似。表明SAA能够明显减轻MI诱导的小鼠心肌损伤。

2.3 SAA对MI小鼠血小板募集及血小板活化的影响Fig 2A-B用IHC染色检测心肌组织中CD42c的表达，应用FCM检测小鼠血液中CD62p的表达；IHC 染色阳性表达的蛋白呈棕黄色，结果表明Sham 组小鼠心肌组织中CD42c以及小鼠血液中CD62p均有一定量的表达；Saline组小鼠心肌组织中CD42c以及小鼠血液中CD62p表达较Sham组明显增加(P<0. 01)；SAA组及Tirfiban组小鼠心肌组织中CD42c以及小鼠血液中CD62p表达均较Saline组明显降低(P<0.05,P<0.01)；提示SAA可以减少MI小鼠心脏组织中血小板的募集，抑制MI小鼠的血小板活化。通过Fig 2C结果可知，SAA对小鼠尾出血时间没有明显的影响。以上结果提示，SAA能够抑制MI诱导的血小板募集及血小板活化，同时不影响小鼠的出血时间。

Fig 1 Effects of SAA on histomorphology of mice with myocardial infarction

Fig 2 Effects of Salvianolic acid A on platelet recruitment, activation and tail bleeding time in infarcted area of mice with myocardial infarction

2.4 SAA对ADP诱导血小板PI3K、Akt、VASP表达的影响Fig 3采用Western blot染色检测小鼠血液中p-VASP/VASP、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白的表达变化，Sham组小鼠血液中p-VASP/VASP、p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT均有一定量的表达；ADP组小鼠血液中p-PI3K/PI3K较Sham组明显升高(P<0.01)，p-AKT/AKT较Sham组明显升高(P<0.05)，p-VASP/VASP较Sham组明显降低(P<0.05) ; SAA 组小鼠血液中p-PI3K较ADP组明显降低(P<0.05,P<0.01)，p-AKT表达较ADP组明显降低(P<0.05，P<0.01)，p-VASP/VASP较ADP 组明显升高(P<0.01)。结果显示，SAA可以上调ADP诱导的血小板中p-VASP的表达，下调p-PI3K和p-Akt的表达，表明SAA可通过调节PI3K、AKT、VSAP蛋白磷酸化发挥抗血小板作用。

Fig 3 Effect of Salvianolic acid A on platelet activation induced by ADP

2.5 SAA对MI小鼠梗死区白细胞及中性粒细胞的影响Fig 4A-B用IHC染色检测心肌组织中CD45以及Ly6G的表达，Fig 4C用IF染色检测心肌组织中CXCL1、CXCL2的表达，IHC染色阳性表达的蛋白呈棕黄色，IF染色阳性表达的蛋白分别呈红色和绿色荧光，结果表明Sham组小鼠心肌组织中CD45、Ly6G、CXCL1及CXCL2均有一定量的表达；Saline组小鼠心肌组织中CD45、Ly6G、CXCL1及CXCL2表达较Sham组明显增加(P<0.01)；SAA组及Tirfiban组小鼠心肌组织中CD45、Ly6G、CXCL1及CXCL2表达均较Saline组明显降低(P<0.05,P<0.01)；提示SAA可以使MI小鼠梗死区的白细胞以及中性粒细胞浸润降低，降低炎性趋化因子的表达。表明SAA能够明显抑制MI诱导的白细胞及中性粒细胞的浸润。

Fig 4 Effect of Salvianolic acid A on leukocyte and neutrophil infiltration in mice with myocardial infarction

2.6 SAA对C3aR的表达及C3a诱导的中性粒细胞活化的影响有研究表明，在心梗患者和实验模型中，心肌组织和外周血中补体的激活与心梗严重程度密切相关[5]，其中补体成分过敏毒素C3a及其受体C3aR已经成为心肌缺血后炎症损伤的重要介质[6]。补体成分C3是补体级联的中心成分，其活化产物C3a可以通过与中性粒细胞表面的C3a受体(complement C3a receptor，C3aR)结合，导致中性粒细胞活化进而促进局部炎症，加重心肌损伤[7]。心肌梗死病理状态下，C3a/C3aR途径易激活中性粒细胞，使其活化。Fig 5A用IHC染色检测心肌组织中C3aR的表达，IHC染色阳性表达的蛋白呈棕黄色，结果表明Saline组小鼠心肌组织中C3aR表达较 Sham组明显增加(P<0.01)；SAA组及Tirfiban组小鼠心肌组织中C3aR表达均较Saline组明显降低(P<0.05)，结果提示SAA可以抑制MI小鼠心肌组织中C3aR的表达，从而降低中性粒细胞的活化。Fig 5B-E用ELISA检测小鼠血液中中性粒细胞活化标志物NE、MPO、MMP9、LF 的释放，C3a模型组与对照组相比NE、MPO、MMP9、LF蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)，SAA组与C3a模型组相比，NE、MPO、MMP9、LF表达明显降低(P<0.05,P<0.01)，结果提示SAA可以抑制C3a及C3a诱导的小鼠血液中中性粒细胞活化。表明SAA可能是通过抑制C3aR及C3a的表达发挥抗中性粒细胞活化作用。

Fig 5 Effects of Salvianolic acid A on neutral particle activation

3 讨论

MI等缺血性疾病严重威胁人类健康，近年来发病趋势呈直线上升，是当今全球最主要的死亡原因之一[8]。在缺血性心血管疾病中，血液呈高凝状态，并伴随动脉及微动脉血栓，激活的炎症性因子促进内皮通透性，介导血小板活化，同时引起免疫系统发生级联反应，形成并扩展动脉粥样硬化斑块，加速动脉血栓形成[9]。中医学理论将缺血性心血管疾病归因于气滞血瘀所致气血流通受阻。传统活血化瘀药有疏通气血，促进缺血组织修复的作用，广泛应用于血瘀证的治疗。丹参具有活血化瘀、除烦益气之功。SAA是丹参重要的水溶性酚酸类化合物，研究表明其具有抗血栓[10]、抗炎[11]等作用，但其作用机制尚未清晰阐明。所以，我们探讨SAA是否通过影响血小板及中性粒细胞活化来改善心肌缺血疾病。

MI导致最初的病变区，其特征是局部产生细胞因子介导的强烈炎症反应。急性MI时，适度的炎症反应是心肌愈合和修复过程中必不可少的，但过度的炎症反应会加重心肌损伤，导致MI[12]。中性粒细胞为MI早期主要的炎性细胞，主要来源于骨髓中的造血干细胞，可刺激趋化因子和炎性介质的释放，促进巨噬细胞、中性粒细胞向缺血区募集。替罗非班在研究和应用中发现具有抑制血小板活化和炎症反应的双重作用。SAA能够改善MI小鼠心脏的心功能及心脏组织形态。同时SAA可以抑制缺血组织中血小板的募集、抑制外周血中血小板的活化，炎性细胞的浸润以及炎性趋化因子CXCL1、CXCL2的释放，从而使缺血后血栓炎症明显减轻，促进缺血区的组织恢复，改善心功能。

血小板是血栓形成的主要介质，对于组织损伤修复至关重要，并且在血管炎症条件下发挥作用。止血失衡会导致动脉粥样硬化斑块形成，导致血栓和局部组织缺血。在正常的机体中，血小板活化处于动态平衡状态，在心肌缺血情况下，激活的血小板可以调节不同的细胞因子和趋化因子的释放，促进组织损伤修复[13]。CD62p从可溶性α致密颗粒中释放，暴露血小板表面，通过白细胞分泌的P选择素糖蛋白配体-1(P selectin glycoprotein ligand 1，PSGL1)与中性粒细胞结合[14]启动细胞内信号，介导整合素活化，加剧细胞间的黏连，进而形成血栓。此外，活化的血小板还可以释放血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)及5-羟色胺等细胞因子，可以通过刺激血管使其收缩并加重血管痉挛，进而诱发血栓形成，流式结果显示，SAA下调CD62p表达量；提示SAA抑制血小板的活化。近年来发现，体内的信号通路如PI3K/Akt、VASP与血小板活化相关，从血小板活化信号通路中研究药物抗血小板作用成为研究重点。已有研究表明，SAA通过PI3K/Akt通路抑制血小板活化[15]，本实验结果对此进行了验证，结果显示SAA通过PI3K/Akt通路发挥抗血小板作用。VASP为血管扩张刺激磷酸蛋白，位于血小板细胞内，通过ADP受体P2Y12信号通路使其磷酸化，受环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，AMP)途径调控，VASP磷酸化水平与血小板活化呈负相关。本实验结果表明丹酚酸A可以上调VASP磷酸化，提示SAA可以通过促进VASP的磷酸化抑制血小板的激活。

中性粒细胞是由骨髓中的造血干细胞产生，干细胞增殖并分化为装备有大量颗粒蛋白的成熟中性粒细胞。这些颗粒蛋白使中性粒细胞能够对微生物产生致命的打击，但也会造成巨大的组织损伤。中性粒细胞作为休眠细胞在血液中循环。在感染部位，内皮细胞绕过中性粒细胞并引导它们通过内皮细胞间隙，由此中性粒细胞被激活和调节，以便随后与微生物相互作用。一旦进入组织，中性粒细胞就会通过从颗粒中释放出来的杀菌物质或代谢活化产生的杀菌物质来杀死微生物。最后，中性粒细胞可以排出附着有杀菌蛋白的DNA，作为微生物的细胞外陷阱[16]。

中性粒细胞损伤周围组织的倾向与其激活状态密切相关，中性粒细胞一旦被激活，就会释放吞噬体或分泌抗菌和炎症蛋白，这些蛋白位于细胞质颗粒中，这一过程被称为脱颗粒反应。脱颗粒反应增强和呼吸爆发是造成重大损害的先决条件。中性粒细胞有4种不同类型的细胞颗粒，储存不同的蛋白分子。初级颗粒主要储存NE、MPO等，次级颗粒主要包含LF和MMP9，三级颗粒富含明胶酶，囊泡主要存储磷酸酶和血浆蛋白等[17]。缺氧显著上调了中性粒细胞主要颗粒的释放，在一定程度上促进了内皮细胞损伤。脱颗粒反应衍生的蛋白质是中性细胞抗微生物以及NET释放过程所必须的。其中NE和MPO 是 NET 形成的必要条件[18]。因此，MPO或NE的水平决定了中性粒细胞激活的程度。中性粒细胞在刺激后更容易受到C3a/C3aR的激活，发生脱颗粒反应。免疫组化结果显示，SAA可以抑制心肌缺血组织中C3aR的表达，从而降低中性粒细胞的脱颗粒反应。ELISA 结果显示，与C3a模型组相比，SAA可以抑制C3a诱导的中性粒细胞脱颗粒，提示SAA通过调控C3a/C3aR 通路抑制中性粒细胞活化过程中的脱颗粒反应。

综上所述，本研究表明SAA能够改善MI小鼠的心功能，显著降低心肌梗死小鼠心脏梗死区的中性粒细胞浸润活化和血小板在心脏梗死区的募集和活化，降低该区域炎症反应。抗血小板作用是通过调节血小板相关的通路PI3K/Akt、VASP发挥作用，降低中性粒细胞活化可能是通过抑制C3aR及C3a的表达发挥作用。