桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效应成分指数构建

李永生，杨媛媛，胡 静，任 慧，崔小敏，曲 彤，李 宁，陈志永*

（1. 西安交通大学医学院附属红会医院 药剂科，陕西 西安 710054；2. 陕西省中医药研究院 中药所，陕西 西安 710003；3. 西安市食品药品检验所 中药室，陕西 西安 710054）

桑白皮为桑科植物桑Morus albaL.的干燥根皮，具有泻肺平喘、利水消肿等功效[1]。桑白皮中主要含有生物碱类、黄酮类、芪类、多糖类等成分[1-2]。现代药理学研究表明桑白皮及其活性成分具有降压[3]、降糖[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等功效。张冉等[7]应用α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型筛选30 味常用清热解表中药的降血糖活性，发现鸭跖草、山慈菇和桑叶具有较好的降糖活性。而本课题组在前期研究中发现桑叶同源中药桑白皮由于含有更多的异戊烯基黄酮类成分（桑根酮C、桑辛素等），其降糖活性优于桑叶[4]，同时兼具显著抗炎、抗氧化活性，使桑白皮成为近年来治疗糖尿病及其并发症领域的热门中药[8-9]。2020 年版《中国药典》（一部）收载桑白皮质量标准包括性状鉴别、横切面鉴别、显微鉴别和薄层鉴别，未收载桑白皮含量测定。段志涛等[10]建立了桑白皮药材的质量标准，该标准包括薄层鉴别和含量测定，能较为全面反映桑白皮质量状况。KIM K等[11]建立了桑白皮中桑黄酮G 和桑辛素的HPLC 含量测定方法，该方法能够区分不同产地的桑白皮样品。但现有桑白皮质量标准存在与临床应用结合不紧密，指标性成分选取不合理，无法反映不同成分对药材整体药效的贡献度差异等问题。

效应成分指数由肖小河课题组首次提出，即根据不同药效成分生物活性的强弱，赋予不同药效成分不同权重，不同药效成分的权重乘以相应药效成分的含量的加和即为效应成分指数，该指数仅通过测定成分的量便能体现药材的效[12-13]。构建桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效应成分指数有望缓解现行桑白皮质量标准存在的问题，实现不同批次桑白皮降糖活性的质量评价。本研究采用谱效关系的方法选择了桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效应成分，采用高效液相色谱法测定了指标性成分含量，并构建了效应成分指数，对进一步提升桑白皮质量控制水平有一定的意义。

1 材料与仪器

10 批次桑白皮药材样品经陕西省中医药研究院陈志永副研究员鉴定，标本存放于陕西省中医药研究院中药所，样品详细信息见表1。桑皮酮H（批号：CHB170413）、氧化白藜芦醇（批号：CHB1709-28）购自成都Chroma 生物技术有限公司；1-脱氧野尻霉素（批号：17093302）、桑黄酮G（批号：16030604）、桑根酮C（批号：16092105）、桑辛素（批号：161109）购自上海圻明生物技术有限公司，所有标准品纯度均大于等于98%。对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷（PNPG，4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside）和α-葡萄糖苷酶（来自Saccharomyces cerevisiae）购自美国Sigma-Aldrich 公司。乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher 公司），水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

表1 桑白皮样品信息Tab. 1 Samples information of Cortex Mori

Agilent 1260 型高效液相色谱仪，配置VWD 检测器和Agilent ChemStation B.04.03 工作站（美国安捷伦科技公司）；KQ-100 型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；BS210S 型电子分析天平（万分之一）、BT25S 型电子分析天平（十万分之一）（北京赛多利斯天平有限公司）。

2 方法

2.1 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性谱效关系研究

2.1.1 样品制备 取桑白皮药材样品粉碎，过40 目筛。精密称取10 批次桑白皮样品粉末各2.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇水溶液100 mL 超声提取2 次，时间为30 min，合并两次提取液，在55 °C减压蒸干。取30.0 mg 提取物，用70%甲醇水溶液溶解，并定容于5 mL容量瓶中，过0.45 μm微孔滤膜，用于桑白皮指纹图谱研究。取提取物20.0 mg 用于α-葡萄糖苷酶抑制活性测定。

2.1.2 桑白皮指纹图谱研究 采用Agilent 5 TC-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）进行色谱分析[14]。流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脱程序为：0 ～ 15 min，5%→15%A；15 ～ 70 min，15%→25%A；70 ～ 90 min，25%A；流速为1.0 mL/min；柱温为25℃；检测波长为280 nm；进样量为10 μL。10 批次桑白皮样品的指纹图谱见图1。

图1 桑白皮样品高效液相指纹图谱Fig. 1 HPLC fingerprint of Cortex Mori samples

2.1.3 桑白皮中1-脱氧野尻霉素含量测定 精密称取“2.1.1”项下制备的桑白皮提取物20.0 mg，精密加入0.05 mol/L 盐酸溶液4 mL，超声提取30 min，补足失重，13 000 r/min 离心10 min。取2 mL 上清液，与4 mL 硼酸盐缓冲液（pH = 8.5）混合，之后加入2 mL 乙腈溶解的FMOC-CL（10 mmol/L）溶液，在20℃下反应20 min。加入0.1 mL 甘氨酸 （1 mol/mL）溶液中和过量的FMOC-CL，加入1.9 mL 0.1% 乙酸水溶液用于使衍生物DNJ-FMOC 处于稳定状态。溶液过0.45 μm 微孔滤膜，用于含量测定。桑白皮提取物中1-脱氧野尻霉素含量测定的色谱条件参考相关研究[15]。色谱分离在Inertsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）上进行。乙腈-0.1%乙酸水溶液（60 ∶40）为流动相；检测波长为265 nm；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min；进样量为15 μL。

2.1.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定方法参考本课题组之前研究[4]。50 μL 桑白皮提取物溶液与50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.25 U/mL）混合，37℃下孵育10 min，加入100 μL溶于磷酸钾缓冲液的PNPG （5 mmol/L），继续在37℃下反应10 min，之后加入1 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液终止反应。405 nm 下测定吸光度值，计算样品的α-葡萄糖苷酶活性抑制率。采用阿卡波糖（10 μg/mL）作为阳性对照。

2.1.5 谱效关系研究 将桑白皮提取物指纹图谱数据进行峰提取、峰对齐等处理。将不同批次样品指纹图谱峰面积、1-脱氧野尻霉素含量、α-葡萄糖苷酶抑制活性数据导入MarkerLynxxs（Waters，Milford，MA，USA）软件，采用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）得到造成α-葡萄糖苷酶抑制活性差异的化学成分。

2.2 桑白皮中5 种成分含量测定

样品制备和含量测定方法参考本课题组之前研究[14]。取桑白皮药材样品粉碎，过40 目筛。精密称取不同批次样品粉末各1.0 g 置于100 mL 具塞锥形瓶中，70%甲醇水溶液50 mL 超声（250 W, 40 kHz）提取30 min，补足失重，摇匀、滤过，取续滤液，0.45 μm 微孔滤膜即得供试品。精密称取氧化白藜芦醇、桑根酮C、桑黄酮G、桑皮酮H、桑辛素适量，加入70%甲醇水溶液中制成浓度依次为0.812 mg/mL、0.100 mg/mL、0.105 mg/mL、0.095 0 mg/mL、0.045 8 mg/mL 的混合标准品储备液。色谱条件同“2.1.2”项下条件。

2.3 效应成分指数构建

根据谱效关系研究结果选取效应成分。效应成分指数（ECI）的构建方法参考本课题组前期研究[16]，其计算公式如下：

式中Wi为各效应成分的药效权重，Wi值越大代表该成分与药效的相关性越强。Xi代表各成分在桑白皮中的含量。Wi的计算公式如下：

3 结果与分析

3.1 桑白皮提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性谱效关系研究

将桑白皮提取物指纹图谱峰面积数据（X）、1-脱氧野尻霉素含量测定数据（X）与提取物α-葡萄糖苷酶活性抑制数据（IC50，Y）进行PLS-DA 分析，详细数据见表2。样本经分析得到两个主成分的模型，模型的解释度R2（X）为85.0%，R2（Y）为91.1%，预测度Q2为75.4%，说明该模型解释能力和预测能力良好，见图2。利用VIP 分析可以验证差异性变量，具有VIP 值大于1 的变量可以用来区 分 样 本。 变 量var_3、var_12、var_4、var_19、var_15、var_7、var_20 和var_11 VIP 值大于1。通过筛除峰面积较小，以及峰形不规则的成分，最终采用标准品比对的方法确定变量var_3、var_12、var_4、var_19、var_15、var_7、var_20 和var_11 分 别 为 桑皮苷A、桑黄酮G、绿原酸、桑辛素、桑皮酮H、氧化白藜芦醇、1-脱氧野尻霉素和桑根酮C。对8 个化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性进行验证，结果表明桑黄酮G（IC50：13.38 μmol/L）、氧化白藜芦醇（IC50：200.9 μmol/L）、桑辛素（IC50：85.91 μmol/L）、1-脱氧野尻霉素（IC50：10.80 μmol/L）、桑根酮C （IC50：26.78 μmol/L）和桑皮酮H （IC50：23.59 μmol/L）具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。作为阳性对照的阿卡波糖的IC50值为23.59 μmol/L，可见桑白皮中的几种化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性较好。

图2 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性的PLS-DA 得分图（A）和VIP 图（B）Fig. 2 The PLS-DA score plot （A） and VIP plot （B） obtained from the groups of Cortex Mori against α-glucosidase inhibitory activity

表2 桑白皮谱效关系研究数据Tab. 2 Data of the spectrum-effect relationship of Mori Cortex

3.2 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性的效应成分指数构建

根据谱效关系研究结果与体外活性筛选验证，选择桑黄酮G、氧化白藜芦醇、桑辛素、1-脱氧野尻霉素、桑根酮C 和桑皮酮H 作为桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效应成分。10 批次桑白皮中6 种成分的含量测定结果见表3。

将6 个效应成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50值导入公式得各成分Wi，将各成分Wi导入效应成分指数（ECI）计算公式：

将桑白皮中6 个成分的含量值带入上述公式即得不同批次桑白皮的效应成分指数值。从表3 可见，不同批次桑白皮中6 个成分含量差异较大，很难通过成分含量的多少鉴定药材的优劣。10 批次桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性的效应成分指数，通过该图可以很清晰的看出6号药材α-葡萄糖苷酶抑制活性最优，见图3。

表3 不同批次桑白皮中6 个活性成分的含量测定（mg/g，n = 3）Tab. 3 Quantification of six active components in different batches of Mori Cortex （mg/g，n = 3）

图3 10 批次桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效应成分指数Fig. 3 ECI of ten batches of Cortex Mori samples against α-glucosidase

3.3 桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效应成分指数的验证

将“2.1.1”项下所制备的不同批次桑白皮提取物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测试。将活性实测值与效应成分指数值进行相关分析，结果表明效应成分指数值与药材α-葡萄糖苷酶抑制活性的1/IC50显著相关（R= 0.983），表明所建立的效应成分指数能够代表桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性。

4 讨论

在建立效应成分指数的过程中，效应成分的选取是重中之重。本研究采用谱效关系结合实验验证的方法，选择桑黄酮G、氧化白藜芦醇、桑辛素、1-脱氧野尻霉素、桑根酮C 和桑皮酮H 作为桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性效应成分。采用该6 种成分构建的效应成分指数，与不同批次药材活性实测值显著相关，表明其能够代表桑白皮α-葡萄糖苷酶抑制活性。采用体外活性测试的方法构建效应成分指数，具有稳定、可控、重复性好等特点。然而，体外研究未考虑体内吸收、分布、代谢、排泄等过程，尚有改进空间。

生物碱类成分1-脱氧野尻霉素为桑白皮中主要降糖成分，其为含氮杂环糖类，此类物质在紫外-可见光区域无吸收，且在一般的反相色谱柱上基本不保留。因此，常选用氨基柱分离，蒸发光散射检测器检测。陈正收等[15]采用柱前衍生化的方法建立了桑白皮中1-脱氧野尻霉素的紫外检测方法，采用FMOC-CL 衍生化后，其在反相色谱柱上具有较好的保留行为。在效应成分指数构建过程中，桑白皮中的黄酮类成分均采用紫外检测器进行定量分析，为提高所构建效应成分指数的实际应用价值，对1-脱氧野尻霉素进行了柱前衍生化，采用紫外检测的方法进行含量测定。

5 结论

构建的效应成分指数能较好地评价桑白皮样品在α-葡萄糖苷酶抑制活性方面的质量，利于提升桑白皮质量控制水平，对推动桑白皮在糖尿病治疗领域的应用具有一定的意义。