硼亲和材料的制备方法新进展*

2022-05-11姚淑婷赵思雨贺茂芳

化学工程师 2022年5期

姚淑婷，杨强，赵思雨，王溥，贺茂芳,b

（西安医学院a.药学院；b.药物研究所，陕西西安 710021）

早在1849年，荷兰科学家Boeseken 等首次发现了H3BO3与顺式二醇类物质之间的共价结合，同时，将H3BO3加入到纸色谱展开剂中，实现了糖类物质的分离与检测。1970年，Weith 等人将苯硼酸键合到纤维素表面用于核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的分离。进入21 世纪以来，硼亲和技术蓬勃发展，成为分析化学、生物医学等领域的研究热点[1]。

硼亲和的作用原理见图1。

图1 硼亲和的作用原理Fig.1 Principle for boronate affinity technique

硼酸基和顺式二羟基在碱性环境中（pH 值大于8.5）形成五元或六元环酯，当环境变为酸性时，环酯解离，从而释放出顺式二羟基分子[2]。该方法有以下优点：（1）选择性好，操作简便，条件温和；（2）酸性洗脱条件有利于离子化，质谱兼容性好；（3）对目标物的捕获和释放过程是可逆反应，不会破坏物质结构；（4）分离富集过程中只需调节溶液的pH 值，无需加入其他物质，减少了干扰。近年来，形式多种多样的硼亲和材料广泛应用于各种小分子化合物（儿茶酚、核苷类等）和生物大分子（糖蛋白、糖肽）的分离富集和检测[3]。本文对近年来新型硼亲和材料的制备方法进行了综述，主要包括点击化学法、原子转移自由基聚合法、超支化聚合物修饰法、分子印迹法和整体合成法。

1 硼亲和材料的制备方法

1.1 点击化学法

点击化学是指通过小分子基团的拼接，简单、高效地完成C-X-C 杂原子化学合成的一类组合化学方法。目前，最常用的点击反应是铜催化的“叠氮-炔基”环加成反应。此外，还有自由基引发的“巯-烯/炔”点击反应。点击反应的反应效率高、副反应少、条件温和，具有很高的化学选择性且不受水氧干扰、环境污染小[4]。因此，将点击反应用于硼亲和材料的制备，可提高硼酸配体的键合量，有利于提高材料的吸附容量。例如，张[5]等人将SiO2进行叠氮化修饰后，以4-氰基苯硼酸为亲和配体，利用点击反应合成了硼亲和硅胶吸附剂。该吸附剂成功从过氧化物酶（HRP）和免疫球蛋白G（IgG）酶解液中富集出糖肽，并应用于人血清中糖蛋白的富集。Zhang[6]以Fe3O4为基质，以4-巯基苯硼酸和3-丙烯酰胺基苯硼酸（AAPBA）为亲和配体，利用“巯-烯”点击化学法合成了两种硼亲和磁性材料，对糖蛋白展现出较高的吸附容量和选择性，对卵清蛋白（OVA）和转铁蛋白（TRF）的吸附容量分别为899.1、159.2mg·g-1。

1.2 原子转移自由基聚合法

原子转移自由基聚合法（ATRP）是向材料表面修饰线性聚合物的一种常用方法，广泛应用于抗污染界面、生物传感界面和分离介质的制备[7]。该方法首先将引发剂键合在材料表面，然后引发单体原位聚合，从而在材料表面生长出线性聚合物刷。通过控制引发剂的密度和聚合时间，可有效调控聚合物刷的接枝密度和链长；同时，聚合物刷的碳-碳骨架灵活，自由度较高。因此，ATRP 法可有效避免聚合物分子间的空间位阻，显著提高聚合物链的接枝密度[8]。近年来，ATRP 技术被成功应用于硼亲和吸附剂的制备，从而提高材料的吸附容量[9-11]。例如，卫[12]以氧化石墨烯为基质、4-乙烯基苯硼酸为单体，通过ATRP 接枝了侧链为苯硼酸的聚合物刷。该材料对OVA 和TRF 的吸附容量分别为514.8，445.9g·g-1。Wang[13]等以氨基化的Fe3O4为基质，AAPBA 为单体进行ATRP 反应，制备了硼亲和磁性纳米吸附剂，并将其应用于生物样品中糖蛋白分离。该吸附剂对糖蛋白显示出良好的吸附选择性，对OVA 和TRF 的吸附容量分别为798.1、278.1mg·g-1，而对非糖蛋白细胞色素C（Cyt C）、溶菌酶（Lyz）的吸附容量分别为53.7、30.8mg·g-1。本课题组[14]以Fe3O4@SiO2为基质、AAPBA 为单体进行ATRP 反应，得到苯硼酸聚合物链修饰的磁性纳米材料（Fe3O4@SiO2@pAAPBA）。该材料对OVA 和辣根过氧化物酶（HRP）的吸附容量分别为373.9、471.3μg·mg-1。最后，将其应用于鸡蛋清中糖蛋白的分离，获得了较高的纯度。研究表明，ATRP 技术能有效提高吸附容量主要有两方面原因[15]：（1）材料表面硼酸配体的密度增高，使材料的吸附位点增多；（2）线性聚合物“分子刷”具有三维纳米结构，分子骨架灵活，有利于传质。

1.3 超支化聚合物修饰法

近年来，通过超支化聚合物修饰法提高硼酸配体的键合量，从而利用“多位点”协同吸附提高亲和力的研究被陆续报道[16,17]。该方法首先将超支化大分子修饰在基质表面，然后利用支链末端的氨基引入苯硼酸，大量苯硼酸的引入促使吸附剂与多个糖基化位点发生协同吸附，从而提高亲和力。例如，Wang 等[18]将树枝状大分子聚酰胺（PAMAM）修饰在Fe3O4表面，然后在树枝分子链末端引入高密度的醛基苯硼酸，凭借“多位点”协同吸附，该吸附剂对糖蛋白的结合常数（Ka）值为105～106M-1，相比于直接键合型吸附剂，亲和力提高了3～4 个数量级。当使用分子骨架灵活性更好、氨基密度更高的聚乙烯亚胺（PEI）代替PAMAM 时，可将Ka值升高至106～107M-1，亲和力进一步提高[19]。然而，树枝状聚合物目前均采用席夫碱反应，使材料表面引入大量氨基，增强了离子作用，使吸附剂的选择性降低。同时，由于大分子之间的空间位阻效应，聚合物分子的接枝密度有限，使吸附容量降低。

1.4 分子印迹法

分子印迹法一般以目标分析物为模板，将模板分子、功能单体、交联剂、致孔剂等混合后在一定条件下进行聚合，形成包裹模板分子在内的聚合物，然后通过适当方式去除模板分子，即得到分子印迹聚合物（MIPs）。MIPs 有着与模板分子三维尺寸和形状相匹配的印迹空腔，能与模板分子特异性结合，不仅有着良好的靶向识别能力，还具有稳定性好、制备简单、成本低廉等优点，因此，广泛应用于分离纯化、生物传感、抗体识别等领域。但大多数印迹方法可控性较差，印迹效率不高，且适用于不同模板分子和基质的通用型印迹技术极为有限，因而，一定程度地限制了分子印迹技术的发展与应用[20,21]。

硼亲和可控定向表面分子印迹技术将硼亲和作用与分子印迹技术有效结合，印迹过程主要通过模板固定、定向印迹和模板移除3 步来实现[22]。该技术不仅印迹效率高、通用性好，还具有亲和力高、选择性好、质谱兼容性高等优点，在顺式二羟基生物分子的高效富集方面有着独特的优势。Sun[23]等以SiO2为核心，通过“硫-烯”点击反应将AAPBA 修饰于SiO2表面，然后利用硼亲和作用定向固定模板糖蛋白HRP，最后，通过多巴胺自聚合得到聚多巴胺涂层的分子印迹材料。在最优条件下，该材料对HRP的吸附容量为0.58μmol·g-1，印迹因子为2.6。Luo[24]等以硼酸功能化的氧化石墨烯为基质、OVA 为模板分子，然后通过有机硅烷的“溶胶-凝胶”聚合法在氧化石墨烯表面形成聚合物涂层，最后除去模板分子，则得到与OVA 的三维尺寸和形状相匹配的3D 印迹空腔。该空腔对OVA 具有双重识别能力，印迹因子达9.5。由于石墨烯的高比表面积和印迹聚合物的协同效应，该材料对OVA 的吸附容量在30min 内可以达到278mg·g-1。

1.5 整体合成法

整体合成法是功能单体、交联剂等在柱管内进行原位聚合反应，得到具有多孔结构的整体柱材料，具有柱容量高、分离速度快的特点[25,26]。例如，杨等[27]首先以四甲氧基硅烷和巯丙基三甲氧基硅烷作为反应单体，采用“溶胶-凝胶”反应制备表面含巯基的硅胶整体柱，然后利用“巯-烯”点击反应在整体柱上修饰AAPBA，制成AAPBA-硅胶杂化亲和整体柱。在中性和碱性条件下，该整体柱对OVA 的吸附容量分别为6.5、1.95mg·g-1。Li[28]等用甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、N,N-甲苯丙胺酰胺（MBAA）为单体，通过热引发自由基共聚法合成环氧功能化毛细管柱基体，再用PEI 修饰基体柱，最后用2,4-二氟-3-甲酰-苯基硼酸进行功能化修饰，得到硼亲和整体材料，成功应用于HPR、RNase B、TRF 混合溶液的富集，吸附容量分别为0.32、0.26、0.26μmol·g-1，该富集过程快速达到平衡且有较好的选择性。