UHPLC-MS/MS 法测定复方夏天无片中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量

陈伟康，黄 东，刘德鸿，刘艳梅，陈 希

（江西省药品检验检测研究院 国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029）

复方夏天无片由夏天无、制草乌、人工麝香、乳香、麻黄等33 味药制成。该药具有祛风逐湿，舒筋活络，行血止痛之功效，临床常用于风湿淤血阻滞，经络不通引起的关节肿痛，风湿性关节炎等[1]。麻黄虽然在处方中药量较小，每1000 片中含1.5g，但由于麻黄中的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱能引起患者发生血压升高[2-4]、兴奋[5]、失眠[6]、心律失常[7]等不良反应，两者在制剂中的含量值得关注。目前，复方夏天无片标准收载于《中国药典》2020年版一部，该标准对麻黄无质量控制项目。因麻黄在处方中的用量较少，而处方药味众多，采用普通HPLC 法分析盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱，存在灵敏度不足，基质干扰严重等缺点，而UHPLC-MS/MS 具有较高的灵敏度和选择性[8]。因此，研究建立复方夏天无片中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的超高效液相串联质谱检测方法，用于评价复方夏天无片中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对患者的影响，具有重要的意义。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Agilent 1290 型超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；API4000 型三重串联四级杆质谱仪（美国AB 公司）；100～1000μL Finnpipette 移液器（美国热电公司）；Sartorius BT 25 S 型天平（赛多利斯（北京）有限公司）；KQ-500E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

盐酸麻黄碱（批号：171241-200506）、盐酸伪麻黄碱（批号：171237-201208），中国食品药品鉴定研究院；复方夏天无片（市售品，规格：薄膜衣片0.32g·片-13 批）；乙腈（色谱纯 美国Sigma-Aldrich 公司）；甲酸（色谱纯 美国TE-DIA 公司）；水为Milli-Q 制备的超纯水。

1.2 液质联用条件

液相色谱仪 采用Themo Scientific（150mm×2mm, 3μm）色谱柱，柱温：40℃。以乙腈-0.1%甲酸为流动相，流速：0.4mL·min-1，梯度洗脱：0～1min（乙腈）=5%，1～5min（乙腈）=5%～70%，5～7min（乙腈）=70%。进样量：1μL。

质谱仪 采用电喷雾离子源（ESI），正离子多反应监测（MRM）模式，离子源温度500℃，喷雾电压5000V，喷雾气60psi，干燥气55psi，气帘气25psi；因盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱为同分异构体，试验表明，两者母离子、子离子以及质谱参数一致，即：母离子166.2，子离子148.3，解簇电压23V，碰撞电压21V。

1.3 溶液的制备

1.3.1 供试品溶液的制备 取复方夏天无片，除去薄膜衣，研细，精密称取0.5g，置50mL 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL ，称定质量，超声处理30min，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.22μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.3.2 对照品溶液的制备 分别精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品12.78、14.68mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，4℃冰箱避光保存。分别精密吸取上述对照品储备液适量，加甲醇稀释成含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱分别为1.278、1.4684μg·mL-1混合对照品溶液。精密吸取上述混合对照品溶液，逐级稀释，配置 成 含 盐 酸 麻 黄 碱1022.43、639.0、255.6、127.8、63.9、51.12ng·mL-1, 含盐酸伪麻黄碱1174.4、734、293.6、146.8、73.4、58.72ng·mL-1系列混合对照品溶液。

2 结果与讨论

2.1 测定条件的选择与优化

本实验比较了HPLC-UV 法和UHPLC-MS/MS两种方法测定待测物。图1 为多反应监测色谱图。

图1 多反应监测色谱图Fig.1 Chromatograms of MRM

因复方夏天无片处方复杂，在210nm 末端吸收下采用HPLC-UV 法测定，灵敏度不高，且盐酸麻黄碱在保留时间50min 出峰还和杂质峰有所包杂；而UHPLC-MS/MS 能在7min 之内完成分析，专属性良好，因此，选用UHLC-MS/MS 进行测定。

2.2 线性关系考察

精密吸取系列混合对照品溶液1μL，注入液质联用仪分析，以待测物浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，用Analyst 工作站拟合标准曲线。结果盐酸麻黄碱在51.12～1022.43ng·mL-1范围内线性关系良好，标准曲线为Y=4.48×103X+8.11×105，相关系数r=0.9998；盐酸伪麻黄碱在58.72～1174.4ng·mL-1范围内线性关系良好，标准曲线为Y=3.95×103X+1.08×106，相关系数r=0.9989。

2.3 精密度考察

取混合对照品溶液，按“2.1 色谱条件”重复测定6 次，结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积RSD 分别为6.3%，4.9%，符合液质联用法仪器精密度要求。

2.4 重现性试验

精密称取供试品粉末6 份，每份0.5g，按1.3.1条件处理成供试品溶液，按1.2 测定。结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量平均值为17.9、7.89μg·g-1，RSD 分别为6.0%，5.6%，重现性符合液质联用法方法学要求。

2.5 回收率试验

精密称取供试品粉末6 份，每份0.25g，分别精密加入盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品溶液（含盐酸麻黄碱90.2ng·mL-1，盐酸伪麻黄碱39.5ng·mL-1）50mL，按1.2 条件测定结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱回收率测定结果见表1。

表1 回收率试验结果（n=6）Tab.1 Results of recovery（n=6）

2.6 样品测定

取江西康恩贝天施康药业有限公司生产的复方夏天无片3 批，按1.2 条件测定，结果见表2。

表2 3 批样品含量测定结果（n=2）Tab.2 Results of content determination of three samples

由表2 数据可知，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱在夏天无片中的含量较低，但上述两种生物碱生物活性较强，其含量波动容易对患有高血压基础疾病的患者产生严重的不良反应。因此，采用UHPLCMS/MS 代替传统的液相色谱法，快速测定基质复杂样品中的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量，控制复方夏天无片中的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量具有一定的意义。

3 结论

麻黄在复方夏天无片处方中含量低，采用普通的液相色谱分析干扰大，分析时间长。本项研究建立了超高效液相色谱法同时测定复方夏天无片中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量的方法，该方法灵敏度高，专属性良好，分析时间短，方法学考察符合要求，可以用于复方夏天无中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的评价。