血清毒蕈碱乙酰胆碱受体m3自身抗体水平对甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断价值

亚库甫·托合提，张凯楠，赵辉，吾布里塔里甫·达吾提，张蕊，林仁勇，吕国栋，

本研究价值：

（1）甲胎蛋白（AFP）广泛应用于肝细胞癌（HCC）的诊断，但约40%的肝癌患者AFP水平并不升高，针对这部分人群的癌症筛查工作进行深入研究具有极重要的实际应用价值。（2）本研究发现血清毒蕈碱乙酰胆碱受体m3自身抗体（m3AchR-Ab）对 AFP阴性HCC具有较高的诊断效能，m3AchR-Ab与AFP进行联合诊断可以提高HCC诊断效能。（3）m3AchR-Ab与HCC严重程度相关，可能在HCC发生、发展过程中发挥着重要作用，但是其具体作用机制尚不清楚，值得进一步研究。

本研究局限性：

本研究的样本量较小，代表性稍差；本研究只探究了m3AchR-Ab在HCC中的表达水平，暂未评估其在其他肿瘤疾病中的表达情况。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床常见的恶性肿瘤之一［1］，死亡率居所有癌症第三位。在中国因HCC死亡的癌症患者仅次于肺癌［2］。HCC病因复杂，早期诊断难度大［3］。目前，甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）已广泛应用于HCC的诊断［4-5］，但其灵敏度仅为41%～65%［6］。在临床上AFP诊断HCC的截断值为20 ng/mL，血清AFP水平＜ 20 ng/ml的HCC被称为AFP阴性HCC［7-8］。AFP阴性HCC患者在早期筛查中容易被漏诊，因此亟须寻找新型生物标志物用于诊断AFP阴性的疑似HCC患者。毒蕈碱乙酰胆碱受体m3自身抗体（muscarinic acetylcholine receptor m3 autoantibody，m3AchR-Ab）是原发性干燥综合征［9］、原发性胆汁性肝硬化［10］等疾病的候选生物标志物。然而，有关其对AFP阴性HCC诊断价值的研究报道较少。本研究通过测量血清m3AchR-Ab水平，探讨其对AFP阴性HCC患者的诊断价值，旨在为AFP阴性HCC患者的临床诊断提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集新疆医科大学第一附属医院标本库于2011年11月至2015年9月入库的257例患者血清样本，其中90例为HCC患者（HCC组），89例为良性肝病（如肝硬化及肝血管瘤）患者（良性肝病组），78例为健康受试者（对照组）。纳入标准：（1）HCC组患者均经病理组织学检查确诊，且符合《原发性肝癌病理诊断实践指南（2015年版）》［11］；（2）良性肝病组患者均经临床、免疫学、影像学及血清学检查确诊；（3）病历资料完整；（4）参与本研究前未行手术、放化疗等治疗。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）合并免疫性疾病、血液系统疾病。受试者均签署知情同意书，本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理审批号：k201906-06）。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集 收集HCC患者一般资料，包括性别、年龄、肿瘤大小（最大直径）和数量、TNM分期、淋巴结转移、远处转移、乙肝表面抗原（HBsAg）等；收集良性肝病患者和健康受试者的性别、年龄等资料。

1.2.2 血清AFP及m3AchR-Ab水平检测 血清AFP水平的检测采用雅培自动化学发光免疫分析仪（Abbott公司生产，型号：Abbott i2000SR）及配套试剂盒（Abbott公司生产，批号：Abbott 3P36/07P90），检测步骤严格按照配套试剂盒说明书进行；血清m3AchRAb水平的检测采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbent serologic assay，ELISA），检测步骤严格按照m3AchR-Ab试剂盒（上海江莱生物科技有限公司生产，货号：JL12216，生产批号：Mar 2021）说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。不符合正态分布的计量资料以 M（P25，P75）表示，两组间比较采用非参数检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清m3AchR-Ab水平对AFP阴性HCC患者的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组、良性肝病组、HCC组和对照组血清m3AchR-Ab水平比较 三组血清m3AchR-Ab水平比较，差异有统计学意义（H=126.30，P＜0.01）。HCC组血清m3AchR-Ab水平高于良性肝病组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；良性肝病组血清m3AchRAb水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 对照组、HCC组、良性肝病组血清m3AchR-Ab水平〔M（P25，P75），ng/ml〕Table 1 Levels of serum m3AchR-Ab among hepatocellular carcinoma patients，benign liver disease patients and healthy controls

2.2 HCC患者临床特征与血清m3AchR-Ab水平的关系血清m3AchR-Ab水平在不同肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移及HBsAg表达情况的HCC患者中比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；血清m3AchR-Ab水平在不同性别、年龄、肿瘤数量和远处转移的HCC患者中比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 HCC患者临床特征与血清m3AchR-Ab水平的关系〔n=90，M（P25，P75），ng/ml〕Table 2 Correlations of serum m3AchR-Ab level with clinicopathological characteristics in hepatocellular carcinoma

2.3 血清m3AchR-Ab、AFP水平诊断HCC的ROC曲线 血清m3AchR-Ab水平诊断HCC的ROC曲线下面积（AUC）为0.89〔95% CI（0.84，0.95）〕，最佳截断值为74.00 ng/ml，灵敏度为88.89%，特异度为91.02%。血清AFP水平诊断HCC的AUC为0.88〔95% CI（0.82，0.93）〕，最佳截断值为27.42 ng/ml，灵敏度为71.11%，特异度为95.81%，见图1、表3。

2.4 血清m3AchR-Ab水平联合血清AFP水平诊断HCC的ROC曲线 运用二元Logistic回归分析得到血清m3AchR-Ab水平与血清AFP水平的联合变量并进行ROC曲线分析，结果显示，血清m3AchR-Ab水平和血清AFP水平联合诊断HCC的AUC为0.90〔95% CI（0.85，0.95）〕，灵敏度、特异度分别为90.00%、80.02%，见图1、表3。

图1 血清m3AchR-Ab、AFP水平和二者联合对HCC诊断价值的ROC曲线Figure 1 ROC curves of serum m3AchR-Ab，AFP，and m3AchR-Ab plus AFP in diagnosing hepatocellular carcinoma

表3 血清m3AchR-Ab、AFP水平及二者联合对HCC的诊断价值Table 3 Diagnostic value of serum m3AchR-Ab，AFP and the combination of them for hepatocellular carcinoma

2.5 血清m3AchR-Ab水平诊断AFP阴性HCC的ROC曲线 经血清AFP水平检测，90例HCC患者中25例为AFP阴性HCC（AFP＜20 ng/ml）。ROC曲线结果显示，血清m3AchR-Ab水平诊断AFP阴性HCC和的AUC为0.69 〔95% CI（0.54，0.83）〕，最佳截断值为 74.00 ng/ml，灵敏度为64.00%，特异度为91.02%，见图2。

图2 血清m3AchR-Ab水平对AFP阴性HCC诊断价值的ROC曲线Figure 2 ROC curve of serum m3AchR-Ab in the diagnosis of AFP-negative hepatocellular carcinoma

3 讨论

在针对疑似HCC患者的诊疗过程中，目前主要依赖血清AFP水平来进行诊断，但是LUO等［12］提出，约40%的HCC患者血清AFP水平并未升高，所以针对AFP阴性的疑似HCC患者的筛查工作进行深入研究具有极重要的实际应用价值。本研究发现血清m3AchRAb水平对诊断HCC具有较高的灵敏度和特异度。相关研究显示，m3AchR-Ab诊断HCC的灵敏度和特异度与AFP、甲胎蛋白异质体（alpha fetoprotein-L3，AFP-L3）、异常凝血酶原（protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ）等相当［13］。本研究还发现，通过联合m3AchR-Ab与AFP可以将HCC的诊断灵敏度提高至90.00%。但本研究目前只检测了m3AchR-Ab在HCC的表达水平，其是否在其他肿瘤中持续高表达仍然未知，需进一步研究并评估其特异性。

吴孟超院士团队提出磷脂酰肌醇蛋白多糖3（glypican-3，GPC3）可以作为AFP阴性的HCC患者的有效筛查指标，其灵敏度为76.70%［14-16］。本研究结果显示，m3AchR-Ab用于诊断AFP阴性HCC的灵敏度与GPC3接近，提示本指标也具有较高的诊断效能，m3AchR-Ab不仅可应用于临床HCC患者的筛查，还能应用于AFP阴性的疑似HCC患者的筛查。此外，m3AchR-Ab与近年来报道的新型生物标志物，如环化酶相关蛋白 2［17］、AFP-L3［18］和 PIVKA- Ⅱ［19］等在诊断AFP阴性HCC时的灵敏度和特异度相当或较优。因此推测m3AchR-Ab是一种AFP阴性HCC的候选生物标志物，具有一定的临床转化价值和应用潜力。

本研究发现m3AchR-Ab在HCC患者血清中高表达，其水平与HCC患者肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和HBsAg表达等临床特征相关。既往研究认为毒蕈碱乙酰胆碱受体m3（m3AchR）参与了结肠癌、胃癌、乳腺癌和肺癌等恶性肿瘤的发生、发展［20］，但是鲜有报道提出m3AchR与HCC的发生、发展相关。本课题组推测m3AchR-Ab可能在HCC发生、发展过程中发挥着重要作用。YU等［21］研究提出，在缺乏外源性m3AchR激动剂的情况下，m3AchR-Ab可能对m3AchR产生激动作用，进而通过下游通路发挥生物学作用，这可能是m3AchR-Ab参与HCC进展的重要机制，但仍需更直接的证据，本课题组也会对该科学假说进行持续研究。

综上所述，m3AchR-Ab是潜在的AFP阴性HCC的筛查指标，同时也可与AFP联用以大幅提高诊断HCC的灵敏度，这在HCC诊断中具有重要临床意义。

作者贡献：亚库甫·托合提进行研究的实施与可行性分析；亚库甫·托合提、张凯楠进行结果的分析与解释，撰写论文；张凯楠进行数据整理；亚库甫·托合提、张凯楠、吕国栋进行论文的修订；赵辉进行数据收集；吾布里塔里甫·达吾提、张蕊进行统计学处理；林仁勇负责文章的质量控制及审校；吕国栋进行文章的构思与设计，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。