基于UPLC-Q-TOF/MSE技术的银花泌炎灵片提取液全成分分析

韩 柳，王翠竹，董庆海，吴福林，李平亚，昌 盛* (.吉林医药学院药学院，吉林 吉林 303；.吉林大学药学院天然药物研究中心，吉林 长春 300)

银花泌炎灵片由金银花、半枝莲、萹蓄、瞿麦、石韦等十味中药组成，是一种有清热解毒、利湿通淋的功效的药物，可以治疗急性肾盂肾炎等症[1]。目前，关于银花泌炎灵的研究大多集中在药理作用、临床应用及不良反应等方面。关于银花泌炎灵片的挥发油化学成分虽有报道[2]，但银花泌炎灵片提取液化学成分的相关研究文献尚少见。药物化学成分是其发挥药理作用的物质基础，一些常用的鉴定化合物的方法，如高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、超高效液相色谱法(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)、气相色谱-质谱法(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS)、超高液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)多需要手动提取各个色谱峰，根据色谱峰中的分子离子峰、碎片离子及保留时间，结合对照品、数据库和有关文献，确定化合物可能的结构[3-4]。但传统分析方法具有重现性差、效率低等局限性。近来，随着技术的发展，一些新的分析技术应用而生。超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱联用技术(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight/mass spectrometr，UPLC-Q-TOF/MS)是一种新的质谱技术[5]，其特点是可以精确测定相对分子质量，灵敏度高、选择性好、分离准确且速度快。所以，本实验采用UPLC-Q-TOF/MS技术对银花泌炎灵片提取液的化学成分进行快速、全面地分析与鉴定。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

银花泌炎灵提取液(吉林华康药业股份有限公司，批号：20180434)；甲酸钠(美国Fisher公司)；甲醇(天津新通精细化工有限公司，分析纯)； UPLC-MS 级乙腈(美国Fisher公司)；亮氨酸-脑啡肽(美国Sigma公司)；质谱用水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

Xevo G2-XS型Q-TOF四级杆飞行时间质谱仪、ACQUITY UPLC型二元泵和样品管理器、V1.7 UNIFYR科学信息学系统(美国Waters公司)；N-A35型氮气发生器(上海金浪科技)；TGL-16aR型飞鸽超离速离心机(上海安亭科学仪器)。

1.2 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，样品管理器温度15 ℃，进样体积5 μL，柱温30 ℃，流速0.4 mL/min，流动相A：0.1%甲酸-水，V/V；流动相B：0.1 %甲酸-乙腈，V/V。梯度洗脱条件：0～2 min，10%B；2～26 min，10%～90%B；26～28 min，90% B；28～29 min，90%～10%B；29～30 min，10%B。

1.3 质谱条件

电喷雾离子化源，MSE continuum模式，正离子及负离子检测模式。m/z100～1500为全扫扫描范围。锥孔电压为40 V，毛细管电压为3.0 kV，锥孔气流量为50 L/h，氩气流量为0.15 mL/min，脱溶剂氮气流量为600 L/h，脱溶剂气温度为300 ℃，源温为120 ℃。亮氨酸-脑啡肽为Lock Spray校正标准液(100 ng/L)，[M+H]+=556.277 1，[M-H]-=554.262 0，实时校正，其校正流速为15 μL/min(正离子模式)，甲酸钠溶液对仪器进行校正。

1.4 银花泌炎灵提取液样本的处理

将银花泌炎灵片粉碎，过筛。精密量取1.0 g银花泌炎灵片粉末，75%乙醇82 ℃水浴，提取3次，每次4 h。过滤后，合并，旋干。取1.0 mL 80%甲醇将提取物溶解，0.22 μm滤膜过滤，备用。

1.5 数据处理

采用UPLC-Q-TOF/MS模式进行采集数据， UNIFI软件对银花泌炎灵片提取液化学成分自动识别。首先，查阅相关文献，建立银花泌炎灵数据库，并将查找到的化合物化学结构保存成.mol格式的文件，并将其导入到分析方法中；接着，通过Waters Compression and Archival Tool v 1.10软件将原始数据压缩；然后应用UNIFI软件自动对数据筛查与鉴定，建立一个过滤筛选方法，设定质量误差为±(6×10-6)且响应值大于3000；最后，结合碎片离子理论精确质量数(Exact Mass Number)、相对保留时间(Relative Retention Time)和化合物结构匹配软件MassFragment、分子式匹配软件Elemental composition、离线及在线质谱数据库(PubMed、Mass Bank、METLIN、Chemspider)以及查阅相关文献分析，对各主要化学成分进行识别和鉴定。

2 结 果

正、负离子模式下的质谱基峰离子流图见图1(正离子)和图2(负离子)。横坐标为时间(min)，纵坐标为相对丰度(%)。通过UNIFI处理系统和MassLynx 4.1对银花泌炎灵片提取液进行定性分析。首先根据质谱得到精确分子质量，然后得到可能的元素组成，最后确定可能的分子式。经过二级质谱分析，特征碎片离子及相关的参考文献，总共鉴定了61个化学成分，包括有机酸类化合物、黄酮类化合物、二萜、三萜及其苷类化合物等。其具体的保留时间(min)、准分子离子峰实测值及理论值、质量误差、分子式、主要碎片离子和来源等相关信息见表1。

图 1 银花泌炎灵提取液正离子模式下的基峰离子流图

图 2 银花泌炎灵提取液负离子模式下的基峰离子流图

表 1 银花泌炎灵全成分鉴定表

续表 1

鉴定结果化合物1：维生素B2；2：亚油酸乙酯；3：2′-(3′,4′-二羟基苯基)乙基-(6″-O-木犀榄苷-11-甲酯)-β-D-吡喃葡萄糖苷；4：槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷；5：7-O-β-D-吡喃葡萄糖基-山柰酚；6：(1S,2S,4R)-反式-2-羟基-1,8-桉叶素-β-D-吡喃葡萄糖苷；7：3-O-阿魏酰奎尼酸；8：獐牙菜苷；9：芹糖甘草苷；10：3-芸香糖槲皮素；11：木犀草素-7-O-β-D-新橙皮糖苷；12：连翘酯苷A；13：(+)-1-羟基松脂酚-4′-4″-二-O-β-D葡萄吡喃糖苷(松脂醇二葡萄糖苷)；14：Conicaoside；15：半枝莲二萜Ⅰ；16：3,4-二咖啡酰氧基奎宁酸；17：(+)-杜仲树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷；18：木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖苷；19：硬脂酸乙酯；20：(-)-表儿茶素五乙酸酯；21：5,3′-二羟基-6,7,4′,5′-四甲氧基黄酮；22：山奈酚；23：2,7-二羟基-4-甲氧基菲-2,7-O-葡萄糖二苷；24：12-α-羟基柠檬苦素；25：5-去羟山柰酚；26：马钱酸-6′-O-β-D-葡萄糖苷；27：β-谷甾醇乙酸酯；28：山柰素-3-O-α-L-(4-O-乙酰基)-鼠李糖基-7-O-α-L-鼠李糖苷；29：3β-氧-甲酰基-7β,12β-二羟基-4,4,14α-三甲基-5α-胆甾-11,15-二酮-8-烯(E)-24-酸；30：半枝莲碱A；31：熊去氧胆酸；32：(E,E)-9-Oxooctadeca-10,12-dienoic acid；33：阿魏酸木蜡醇酯；34：Coronaric acid；35：3,3′-二羟基-2-(对羟苄基)-5-甲氧基联苄；36：异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷；37：升麻醇木糖苷；38：5-胆酸甲酯-3-O-β-D-葡萄糖苷；39：3-表齐墩果酸；40：二十一烷酸；41：蜕皮甾酮-3-O-β-D-葡萄糖苷；42：巨大戟萜醇-3-棕榈酸酯；43：3-O-咖啡酰-3β,11α-二羟基-12-齐墩果烯；44：Platycoside M-1_16；45：毛冬青皂苷甲；46：棕榈酸；47：连翘苷：48：胡萝卜醇；49：正二十一烷醛；50：Tuberoside Q；51：正二十三烷酸；52：Trachelosperoside E-1；53：二十五烷酸；54：7β-羟基升麻醇木糖苷；55：棕榈酸乙酯；56：贯叶金丝桃素；57：齐墩果酸甲酯；58：3-O-D-laminaribiosyl polygalacic acid_45；59：α-羟基-二十四酸；60：β-谷甾醇-3-O-D-葡萄糖苷；61：齐墩果酸3-O-β-D-(6′-O-甲基)-吡喃葡萄糖醛酸苷

3 讨 论

本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS结合UNIFI天然产物分析平台对银花泌炎灵提取液化学成分进行快速的分析与鉴定。UNIFI分析平台具有分析高效、全面的特点，目前数据库中含有6000多种化合物信息，涵盖600多味中药材[6]。实验中向数据库补充录入已有文献报道的银花泌炎灵化学成分信息，包括化学式、结构、摩尔质量等，建立银花泌炎灵片专属的数据库。将原始质谱数据导入UNIFI分析平台中，通过设置合适的参数，来对原始的数据进行校正和识别，与目标数据库自动匹配并生成报告。相比于传统鉴定方法，UPLC-Q-TOF/MS技术结合UNIFI分析平台的方法，具有耗时短、效率高、分析全面等优点，已经被应用到快速鉴定传统中药乃至于中药复方中的化学成分[7]。

本实验共鉴定出银花泌炎灵片提取液中61种化学成分，所建立的检测方法为银花泌炎灵片提取液提供了一种快速鉴定化学成分的方法，同时为银花泌炎灵片的药效物质基础阐明提供了科学的依据。