基于体外受精-胚胎移植助孕女性患者年龄对早期胚胎发育动力学参数及胚胎发育潜能影响的Time-lapse 技术评估

杨冬宇, 陆 杉, 曹晓静, 陈旭龙, 李思楠, 卢兴宏, 倪运萍, 谢 妍

（广州中医药大学第二附属医院生殖医学科，广东 广州 510120）

随着年龄的增长，高龄女性卵巢中卵母细胞储备耗竭、卵母细胞质量下降和非整倍体率增加，而卵母细胞质量直接影响胚胎质量，高龄女性的妊娠率和活产率下降，流产风险明显增高，提示高龄不孕症发生率逐渐增加可能与胚胎质量下降密切相关［1-2］。现有的形态学评分系统并未发现女方年龄与受精率和胚胎质量存在相关性［3］，近年来，基于动力学评估胚胎的时差成像技术得到广泛的应用，该技术为胚胎学家提供了更多的胚胎优选动态参考指标［4］。基于囊胚形成率、着床成功率和带回家婴儿率逻辑回归模型已被用于证明胚胎发育动力学有利于预测胚胎的着床潜能［5-6］。然而关于女性患者年龄是否为胚胎发育动力学影响因素的相关报道有限。GRYSHCHENKO 等［7］研 究 表 明：女 方年 龄对胚胎发育动力学参数无影响，但该研究只纳入了86 枚胚胎生物数据， 存在一定的局限。WARSHAVIAK 等［8］对≥42 岁 和＜35 岁 女 性 患 者胚胎发育动力学参数进行比较，未发现2 组患者动力学参数存在差异，并认为年龄可能不是胚胎发育动力学的影响因素，但该研究未对35～42 岁女性患者胚胎发育动力学数据进行分析。金海霞等［9］对≥35 岁和＜35 岁女性患者的胚胎发育动力学进行比较，与≥35 岁组女性患者比较，＜35 岁组女性患者胚胎发育至3 细胞和4 细胞的速度更快，认为女性患者年龄对部分动力学参数有一定的影响。女性患者年龄是否为胚胎发育动力学的影响因素至今仍存在争议。本研究将女性患者按年龄进行分组，分别比较＜30岁组、30岁≤患者年龄＜40岁组和≥40 岁组患者发育动力学参数，通过比较不同年龄组胚胎发育动力学参数的差异，阐明患者年龄对胚胎发育潜能的影响，进一步探讨患者年龄与胚胎质量的关系，同时为时差成像技术的更广泛应用提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究回顾性分析2019年10月—2020年12月于本院生殖医学科行体外受精-胚胎移植（in vitrofertilization and embryo transfer，IVFET）助孕治疗不孕女性的临床资料。根据患者年龄分为3 组：＜30 岁组（48 例，439 枚胚胎）、30 岁≤患者年龄＜40 岁组（129 例，1019 枚胚胎）和≥40 岁组（48 例，176 枚胚胎），所有胚胎置于时差成像系统（Time-lapse）中培养至第3 天。本研究使用药品及试剂：促性腺激素（gonadotripin，Gn）（瑞士默克雪兰诺公司），人绒毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）（中国丽珠公司），受精液（IVF-plus） 和胚胎分裂液（G1-plus）（瑞典Vitrolife 公司）。仪器：时差成像系统（Primo Vision）（瑞典Vitrolife 公司），胚胎培养箱（德国Labtect 公司）。纳入标准：①年龄22～45 岁；②存在双侧卵巢；③患者夫妇满足IVF-ET 指征。排除标准：①重度子宫内膜异位症或子宫腺肌症者；②双侧输卵管积水且未经处理者；③患有不适合目前进行辅助生殖技术或者患有不适合妊娠的疾病者；④未获卵或无正常受精胚胎者。

1.2 促排卵与取卵3 组患者均采用拮抗剂方案行超促排卵，当主导卵泡达到以下条件之一时行扳机操作：①1 个主导卵泡直径≥19 mm；②2 个主导卵泡直径≥18 mm；③卵泡直径≥14 mm 的卵泡数中有60%以上卵泡直径≥16 mm 时，于当晚注射HCG 4000～10000 U，36 h 左右行取卵手术。

1.3 受精、胚胎培养和延时摄影经B 超下引导行取卵术回收卵母细胞，对取卵日丈夫留取的精液样本进行优化处理，常规体外受精；受精后16～18 h后脱颗粒观察卵母细胞受精情况，将正常受精卵转移至微孔培养皿中培养，培养环境：37 ℃、6.0%CO2。本研究采用Time-lapse 技术拍照频率为每次5 min，曝光时间为每次70 ms，连续拍摄72 h，监测胚胎的动态发育过程，观察并记录3 组胚胎分裂的发育动力学参数、异常卵裂发生率、可利用胚胎数、优质胚胎数和发育至2～8 细胞的比例。

1.4 胚胎移植和妊娠检查取卵后第3 天结合胚胎发育动力学参数和形态学参数标准，结合患者身体条件，挑选1～2 个胚胎移植，移植后14 d 检查是否妊娠，妊娠者继续黄体支持治疗，移植30 d 后以B 超下观测到孕囊并有胎心搏动为临床妊娠。

1.5 统计学分析采用SPSS 18.0 统计软件进行统计学分析。3 组患者女方年龄、男方年龄、体质量 指 数（body mass index， BMI）、 窦 卵 泡 数（antral follicle count，AFC）、不孕年限、基础卵泡刺激素（bsal follicle-stimulating hormone，bFSH）、基 础 黄 体 生 成 素 （basal luteinizing hormone，bLH）、基础雌性激素（basal estrogen，bE2）、抗穆勒氏管激素（anti-Mullerian hormone，AMH），治疗参数和胚胎动力学参数符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；2 组患者2 原核（2 pronuclears，2PN）受精率，卵裂率，胚胎着床率，临床妊娠率，逆分裂率，1 裂3 率和2 裂5 率，碎片化率，发育至2 细胞、3 细胞、4 细胞、5 细胞、6 细胞、7 细胞和8 细胞比例以百分率（%）表示，组间率的比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组患者基础资料对3 组患者基本资料进行组间比较，≥40 岁组患者女方年龄、男方年龄、BMI、不孕年限高于＜30 岁组和30 岁≤患者年龄＜40 岁组（P＜0.05），≥40 岁组AFC 少于＜30 岁组和30 岁≤患者年龄＜40 岁组（P＜0.05），≥40 岁组AMH 低于＜30 岁组和30 岁≤患者年龄＜40 岁组（P＜0.05）。3 组患者bFSH、bLH 和bE2 比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3 组患者基本临床资料Tab.1 Clinical materials of patients in three groups (-±s）

表1 3 组患者基本临床资料Tab.1 Clinical materials of patients in three groups (-±s）

“—”：No data；*P＜0.05 compared with ＜30 years old group；△P＜0.05 compared with 30 years old ≤patients’age＜40 years old group.

Group＜30 years old 30 years old≤patients’age＜40 years old≥40 years old FP Group＜30 years old 30 years old≤patients’age＜40 years old≥40 years old FP n 4812948— —Duration of infertility（year）2.4±1.53.7±2.9*4.7±3.4*8.527＜0.001 Age of female（year）27.2±1.734.0±2.8*41.6±2.8*△370.371＜0.001 bFSH[λB/（IU·L—1）]6.6±1.78.1±8.38.4±3.41.1110.331 Age of male（year）30.0±3.336.7±5.3*42.6±4.1*△88.971＜0.001 bLH[λB/（IU·L—1）]7.2±4.26.8±5.55.5±2.61.8080.166 BMI（kg·m—2）21.4±2.422.2±3.123.4±3.4*△5.4370.005 AMH[λB/（IU·L—1）]5.2±3.83.8±3.3*1.4±1.1*△18.120＜0.001 AFC 22.6±11.217.2±11.1*7.1±4.4*△29.962＜0.001 bE2[ρB/（pmol·L—1）]161.7±77.3167.2±88.1202.4±88.12.4210.091

2.2 3 组患者治疗参数和结局对3 组患者促排卵资料和治疗结局进行比较，与＜30 岁组比较，30 岁≤患者年龄＜40 岁组和≥40 岁组患者Gn 启动剂量和Gn 使用总剂量增加（P＜0.05）；≥40 岁组患者扳机日内膜厚度高于＜30 岁组和30 岁≤患者年龄＜40 岁组（P＜0.05）；≥40 岁组患者获卵数、可利用胚胎数和优胚数少于＜30 岁组及30 岁≤患者年龄＜40 岁组（P＜0.05），3 组患者移植胚胎数、2PN 受精率、卵裂率、胚胎种植率和临床妊娠率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 3 组患者治疗参数及结局Tab.2 Parameters and outcome of treatment of patients in three groups

2.3 3 组患者胚胎发育动力学参数3 组患者胚胎的从受精到3 细胞时间（time from fertilization to division into 3 cells stages，t3）、从受精到4 细胞时间（time from fertilization to division into 4 cells stages，t4）、从受精到5 细胞时间（fertilization time to division into 5 cells stages，t5）、从受精到6 细胞时间（time from fertilization to division into 6 cells stages，t6）和从2 细胞分裂到3 细胞的时间（time from 2 cells to 3 cells，cc2）差异有统计学意义（P＜0.05），其中30 岁≤患者年龄＜40 岁组患者从受精到2 细胞时间（time from fertilization to division into 2 cells stages，t2）和t6 长 于＜30 岁 组（P＜0.05），≥40 岁组t3 长于＜30 岁组和30 岁≤患者年龄＜40 组（P＜0.05），且30 岁≤患者年龄＜40 岁组t3 长于＜30 岁组（P＜0.05），≥40 岁组t4 和t5 长于＜30 岁组（P＜0.05），≥40 岁组cc2 长于＜30 岁组和30 岁≤患者年龄＜40 岁组（P＜0.05）， 3 组患者原核消失时间（time from fertilization to the disappearance of the two pronucleis，tPNF）、从受精到7 细胞时间（time from fertilization to division into 7 cells stages，t7）、从受精到8 细胞时间（time from fertilization to division into 8 cells stages，t8）、从3 细 胞 分 裂 至4 细胞的时间（time from 3 cells to 4 cells，s2）、从5 细胞分裂至8 细胞的时间（time from 5 cells to 8 cells，s3）和从3 细胞分裂到5 细胞的时间（time from 3 cells to 5 cells，cc3）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 3 组患者胚胎动力学参数Tab. 3 Embryo kinetic parameters of patients in three groups (t/h,-±s）

表3 3 组患者胚胎动力学参数Tab. 3 Embryo kinetic parameters of patients in three groups (t/h,-±s）

“—”：No data；* P＜0.05 compared with ＜30 years old group；△P＜0.05 compared with 30 years old≤patients’age＜40 years old group.

Group＜30 years old 30 years old≤patients’age＜40 years old≥40 years old FP Group＜30 years old 30 years old≤patients’age＜40 years old≥40 years old FP No.of embryos 4391019176— —No.of embryos 4391019176— —tPNF 25.3±3.425.8±3.925.6±4.02.6580.070 t756.3±5.657.1±5.757.7±5.02.8030.061 t228.0±3.928.6±4.4*28.8±4.73.3840.034 t857.8±5.358.3±5.559.8±5.13.010.050 t337.7±5.138.9±5.9*40.0±6.8*△10.353＜0.001 s2(t4-t3)2.8±4.52.6±4.52.4±3.90.6540.520 t440.4±5.541.3±6.342.2±6.2*5.0760.006 s3(t8-t5)8.5±6.37.5±6.48.8±6.61.9960.137 t551.3±7.052.3±7.653.5±7.4*1.1370.016 cc2(t3-t2)9.8±4.110.4±4.211.7±4.9*△10.137＜0.001 t654.4±6.055.4±6.5*55.7±6.83.080.046 cc3(t5-t3)14.0±5.714.2±5.614.9±6.51.0960.334

2.4 3 组患者胚胎异常卵裂事件发生率3 组患者碎片化率比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中30 岁≤患者年龄＜40 岁组和≥40 岁组高于＜30 岁组（P＜0.05），3 组患者2 裂5 率比较差异有统计学意义（P＜0.05），≥40 岁组2 裂5 率高于＜30 岁组和30 岁≤患者年龄＜40 岁组（P＜0.05），3 组患者胚胎逆分裂率和1 裂3 率比较差异无统计学意义（P＞0.05），但≥40 岁组较＜30 岁组和30 岁≤患者年龄＜40 岁组相比有升高的趋势。见表4。

表4 3 组患者异常卵裂事件发生情况Tab.4 Proportion of abnormal cleavage events in three groups ［η/%（n/N）］

2.5 3 组患者胚胎分裂比例对3 组胚胎分裂比例进行比较，成功分裂至2 细胞、3 细胞和4 细胞的比例差异无统计学意义（P＞0.05），3 组患者胚胎分裂至5 细胞、6 细胞、7 细胞和8 细胞比例比较差异有统计学意义（P＜0.05），与＜30岁组和30岁≤患者年龄＜40 岁组比较，≥40 岁组胚胎分裂至5 细胞、6 细胞和7 细胞的比例降低（P＜0.05）；≥40 岁组胚胎分裂至8 细胞的比例低于＜30 岁组（P＜0.05）。见表5。

表5 3 组患者胚胎在特定发育阶段的百分比Tab.5 Percentages of embryos existing at specific developmental stages of patients in three groups ［η/%(n/N)］

3 讨论

一些研究利用静态评估探讨女性年龄和胚胎形态间的关系，结果表明：常规使用的形态评分系统，如卵裂球数目和卵裂球形态评分等与年龄无相关性［3，10-12］，因此本研究拟通过对胚胎动力学参数分析来探讨年龄对胚胎发育的影响。

Time-lapse 技术在辅助生殖领域大量应用，为研究者挖掘胚胎发育潜能信息提供了新的途径，Time-lapse 技术的主要特点是对胚胎发育过程进行高质量连续的图像采集，较传统倒置显微镜下观察更安全，可将外界环境的干扰降至最低。Timelapse 技术采集图片时间频率为5～10 min，对胚胎动态学观察和异常分裂事件的记录同步进行，充分记录胚胎发育过程中的全部动态信息［13-15］。近年来关于胚胎动力学信息与胚胎发育潜能的研究已成为辅助生殖专家们感兴趣的热点论题，研究者对胚胎动力学的影响因素进行了一系列的探索，COBO 等［16］对玻璃化冷冻后的卵母细胞在形成胚胎后的胚胎动力学信息进行观察，新鲜卵母细胞和玻璃化冷冻卵母细胞来源胚胎的着床率相似，但在t2 到囊胚发育动力学方面有明显差异。

本研究共纳入225 例患者的1634 枚胚胎，将患者按年龄分为3 组，结果显示：与＜30 组和30 岁≤患者年龄＜40 岁组比较，≥40 岁组t3、t4 和t5 增 加，≥40 岁 组cc2 也 增 加，3 组 患 者tPNF、t2、t6、t7、t8、s2、s3 和cc3 比 较 差 异 无统计学意义。AKARSU 等［17］研究表明：在卵巢储备正常的情况下，年轻组（20～30 岁） 从授精到tPNF 和t2、t3 及t4 明显短于高龄组（30～40 岁），与本研究结果一致。纪冰等［18］比较着床胚胎与未着床胚胎的发育时间参数，结果表明：tPNF、t2、cc2 和s2 对胚胎发育潜能具有一定的预测价值，着床胚胎的发育速度相对更快，发育时间更集中，即在一定时间范围内发育快的胚胎其发育潜能更高，在范围之外发育较快或较慢可能会对胚胎质量产生不良影响。以上研究结果表明：年轻患者的胚胎及发育潜能好的胚胎均具有早期卵裂速度较快的趋势，本研究的结果也表明：＜30 岁组患者到达2～6 细胞阶段用时更短，患者年龄在一定程度上可能影响胚胎的发育速度。

胚胎发育过程中出现逆分裂和不均等分裂的异常分裂现象时可导致其着床潜能的降低［19-20］。随年龄的增长，高龄女性的卵母细胞和胚胎出现染色体异常概率也相应增加。诱发胚胎卵裂模式异常的主要原因可能是胚胎出现非整倍体或基因异常现象［21］。本研究结果显示：与＜30 岁组和30 岁≤患者年龄＜40 岁组比较，≥40 岁组患者更易出现2 裂5 异常分裂现象，同时胚胎碎片化程度也明显升高，虽然3 组患者逆分裂、1 裂3 的异常分裂模式差异无统计学意义，但≥40 岁组有升高趋势，推测高龄女性卵母细胞及其产生的胚胎的高染色体异常率促进了异常卵裂模式的发生。

本研究对3 组胚胎第3 天发育至不同细胞阶段的比例进行了比较，结果显示：≥40 岁组仅有33.5% 的胚胎可以发育至8 细胞，与＜30 岁组（45.3%） 比较，差异有统计学意义，3 组胚胎能够成功发育至5、6 和7 细胞比例也有统计学意义，≥40 岁组较＜30 岁组和30 岁≤患者年龄＜40 岁组更容易出现发育阻滞，提示年龄的增长可能是制约胚胎发育潜能的一个主要因素。

随着年龄的增长，临床妊娠率和胚胎着床率均会明显下降这一事实已被研究［1，12］所证实，但本研究结果中3 组患者的临床妊娠率和胚胎着床率比较差异无统计学意义，主要是因为最终移植周期数相对较少所致，因纳入的病例采用拮抗剂促排卵方案，早发黄体生成素（luteinizing hormone，LH）峰的出现影响子宫内膜的形态，移植日取消移植的周期数占比较高。

综上所述，随着年龄的增长，胚胎发育动力学受到一定的影响，胚胎也更容易出现发育阻滞的现象。希望本研究能够为补充胚胎发育动力学的一些临床意义提供理论支持。本研究为单中心回顾性分析，需加大样本量对某些具有一定差异趋势但未表现出统计学差异的参数进行探讨，进一步证实其在胚胎发育过程中的潜在意义。