miR-200家族及侵袭相关基因ZEB1、ZEB2和CTNNB1在颅咽管瘤组织中的表达及意义

张道宝，徐建国

颅咽管瘤(craniopharyngioma,CP)是常见的中枢神经系统肿瘤，任何年龄均可发病，但其常见的发病年龄呈双峰分布，即主要有6～14岁和50～70岁两个高发年龄段，同时CP是儿童最常见的鞍区占位性病变[1--2]。CP在病理学上可分为两种亚型，即造釉细胞型颅咽管瘤(adamantinomatous craniopharyngioma，ACP)和鳞状上皮乳头型颅咽管瘤(papillary craniopharyngioma，PCP)[3]。CP的侵袭性研究已成为近年来的研究热点，目前取得了一定进展，但是仍有很多不足。已有研究证实miR-200家族在肿瘤侵袭中起到重要作用，本研究初步探讨了miR-200家族在CP组织中的表达情况及其意义。

1 材料和方法

1.1 材料 收集四川大学华西医院2017年6月—2018年12月经手术切除的ACP、PCP新鲜标本各30例作为研究对象，并且选取同时期在华西医院神经外科因颅脑外伤而行开颅手术切除的30例失活脑组织作为对照组。本研究已通过医院伦理委员会审核批准，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 方法 HE染色观察各组组织的病理变化；免疫组化法检测各组组织中E-cadherin和β-catenin的变化；qRT-PCR测定各组组织中miR-200b-3p、miR-200a-3p、miR-200c-3p、miR-429-3p、miR-141-3p及ZEB1、ZEB2、CTNNB1相对表达水平。

2 结 果

2.1 各组HE染色情况 首先，对照组、PCP组和ACP组均有各自明显的组织特征:对照组细胞分布均匀，无异常增生；PCP组由单一的多边形密集排列的鳞状上皮细胞(黄色箭头指示)构成；而ACP组具有呈栅栏状排列的上皮细胞(红色箭头指示)，有漩涡状细胞簇(蓝色箭头指示)等特点。再次是肿瘤与周围组织交界的特点：PCP组细胞与周围组织交界线比较平整，没有见到明显向周边组织延伸的迹象；而ACP组呈“指样”或“岛样”深入周围脑组织，呈浸润性生长，侵袭性明显(如黑色箭头所示)。见图1。

图1 各组HE病理染色结果

2.2 免疫组化法检测各组E-cadherin和β-catenin变化 根据镜下染色深浅，与PCP相比，ACP的β-catenin的表达略有升高，且分布在细胞质或者细胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在细胞膜上(图2A), 与之相反的是，ACP相对于PCP，E-cadherin的表达下降了(图2B)。

A：β-catenin在ACP主要在细胞质或者细胞核内表达(黑色箭头)，且表达较正常神经组织(蓝色箭头)及PCP(红色箭头)中升高； B：E-cadherin在ACP(黑色箭头)的表达较在PCP(红色箭头)的表达降低

2.3 各组中miR-200家族成员相对表达水平 各组miRNA-200a的相对表达水平比较，ACP组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组miRNA-200b的相对表达水平比较，ACP组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组miRNA-200c的相对表达水平比较，ACP组低于对照组，也低于PCP组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组miRNA-429的相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。各组miRNA-141的相对表达水平比较，ACP组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

*/#表示P<0.05，**/##表示P<0.01，***/###表示P<0.001；*：normal vs ACP，#：PCP vs ACP

2.4 qRT-PCR测定各组侵袭相关基因相对表达水平 各组ZEB1、ZEB2、CTNNB1的相对表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，ACP组高于对照组，也高于PCP组。见图4。

*：与normal相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；#：与PCP相比；#表示P<0.05，##表示P<0.01

3 讨 论

多数CP在组织学上为良性肿瘤，恶性CP罕见，但在临床病程中却有着与恶性肿瘤相似的特征。术后易复发是CP，特别是ACP的一个重要特点。有文献报道，CP术后患者经过10年随访，其复发率可高达到90%[4]。本研究对3组标本分别进行HE染色发现，正常脑组织细胞分布均匀，无异常增生；PCP组织由单一的多边形密集排列的鳞状上皮细胞构成，与周围组织交界线比较平整，没有见到明显向周边组织延伸的迹象；而ACP组织具有呈栅栏状排列的上皮细胞，具有漩涡状细胞簇等特点，呈“指样”或“岛样”深入周围脑组织，呈浸润性生长，侵袭性明显。

目前在人类基因组中，已发现一千多种miRNA，通过基因调控调着大约30%以上的人类基因[5]。miRNA参与对细胞各种生命活动的调节，包括正常细胞的增殖分化、凋亡，并和肿瘤的发生、发展有密切的关系[6-8]。miRNA-200家族与许多肿瘤的进展和转移密切相关，miRNA-200家族共有5个成员组成，根据其“种子序列”不同又可分为两个亚族：miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-200a、miRNA-200b及miRNA-429，前者共同序列“AAUACU”；后者为“AACACU”, 两者之间相差一个核苷酸(C和U)，因它们拥有不同的“种子序列”，所以具有不同的结合特异性，调节的靶基因也有细微的差别，但它们仍有许多共同的靶基因。研究发现，在膀胱癌、子宫内膜癌、前列腺癌等多种肿瘤中，miRNA-200家族的表达明显低于肿瘤附近的正常组织[9-16]。本研究利用qRT-PCR测定各组miRNA-200家族的表达水平发现，与正常脑组织组相比，ACP组中miRNA-200家族表达整体趋势是下降的，其中miRNA-200c的下降最为明显，差异性显著。而PCP相比于正常脑组织，其miRNA的表达虽然略有下降，但是并不明显，也没有特别突出的亚型。与PCP相比，ACP中miRNA-200家族整体也是下降的，同样是miRNA-200c这个亚型下降最为明显。本研究结果说明miRNA-200家族在CP，特别是ACP中表达明显下降，可能起到类似于抑癌基因的作用。

miRNA-200家族主要在上皮细胞中表达，是上皮细胞的标志物[17]，同时在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的过程中扮演了重要角色。E盒结合锌指蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)是重要的细胞核转录因子，包括ZEB1/ZEB2，可以直接抑制E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)的表达[18]。miRNA-200家族可直接抑制ZEB1/ZEB2，进而调控EMT[19]。Oba等[20]通过miRNA与ZEB-2的mRNA3′UTR互补序列分析，发现miRNA-200家族对ZEB-2作用显著，与对照组相比，能抑制ZEB-2 80%的活性。miRNA-200家族过表达后，可结合在ZEB1/ZEB2的3′UTR区使其靶向降解，并使E-cadherin表达上调，从而抑制EMT的发生，降低肿瘤的侵袭性和转移性。同时，ZEB1/ZEB2也能直接抑制miRNA-200家族的转录，两者之间形成一个负反馈环路，起到相互抑制的作用。本研究利用qRT-PCR技术测定各组ZEB1/ZEB2的表达水平发现，与正常组相比，ACP组中ZEB1/ZEB2表达整体趋势是上调的，其中ZEB2的上调最为明显，差异性显著；而PCP相比于正常组织，ZEB1/ZEB2变化不显著；与PCP相比，ACP的组织中ZEB1/ZEB2表达整体也是上调的；由此可知，在ACP中ZEB1/ZEB2的表达明显上调。利用免疫组化技术检测CP中E-cadherin的表达，结果表明ACP组相对于PCP组，E-cadherin的表达下降了。综上，在ACP中，存在这样一个通路，随着miRNA-200家族表达明显下调，导致ZEB1/ZEB2表达上调，进而使E-cadherin的表达受到了明显抑制。

β-连环蛋白(β-catenin)由原癌基因CTNNB1编码，是一种多功能、高度保守的细胞骨架蛋白。β-catenin可以存在细胞质、细胞膜和细胞核中，研究发现正常神经细胞中的β-catenin主要在细胞膜中表达，而ACP中β-catenin在细胞膜内低表达，在细胞质及细胞核内过表达，并且这些细胞多位于实体瘤边缘浸润性较强的位置[21]。本研究利用qRT-PCR技术测定各组CTNNB1的表达水平发现，与正常组相比，ACP组中CTNNB1表达整体趋势是上调的，差异性显著；而PCP相比于正常组织，CTNNB1变化不显著；与PCP相比，ACP的组织中CTNNB1表达整体也是上调的；由此可知，在ACP中CTNNB1的表达明显上升。通过免疫组化测定，与PCP相比，ACP的β-catenin的表达有升高，且分布在细胞质或者细胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在细胞膜上。综上，在ACP中，随着miRNA-200家族表达的明显下调，其与靶基因CTNNB1的结合减少，导致CTNNB1表达上调，使其编码蛋白β-catenin的表达升高。

相对于正常脑组织，ACP组中miRNA-200家族表达整体下降，其中miRNA-200c的下降最为明显，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)表达整体上调，其中ZEB2的上调最为明显；PCP相比于正常脑组织，miRNA-200家族的表达略有下降，但是并不明显，也没有特别突出的亚型，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)变化不显著；与PCP相比，ACP组织中miRNA-200家族整体下降，同样是miRNA-200c这个亚型下降最为明显，mRNA(ZEB1/ZEB2,CTNNB1)的表达整体上调。ACP的β-catenin的表达升高，且分布在细胞质或者细胞核，而PCP中β-catenin偏向于分布在细胞膜上。ACP相对于PCP，E-cadherin的表达下降。综上所述，miRNA-200家族在CP中可能起到类似于抑癌基因的作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。