石斛酚对大鼠急性心肌梗死保护作用的机制研究

范 斐

（江苏省中医院，江苏 南京 210004）

0 引言

急性心肌梗死（AMI）和随之而来的心力衰竭是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因之一［1］。AMI后，减少急性心肌缺血/再灌注损伤（IRI）、挽救存活心肌和限制心肌梗死（MI）范围的最有效治疗方法是及时使用直接经皮冠状动脉介入治疗（PPCI）进行心肌再灌注［2］。然而，自相矛盾的是，心肌再灌注过程本身会导致心肌细胞死亡和心肌损伤，可占最终心肌梗死面积的50%［3］。因此，AMI 后的死亡率和发病率仍然很高，需要新的治疗方法来缩小心肌梗死的范围，防止不利的左室重构，以减少心力衰竭的发生，改善AMI后的临床结果。

急性IRI 的炎症反应在决定AMI 大小和随后的MI后不利的左心室重构方面起着关键作用［4］，使其成为改善AMI 患者临床预后的潜在治疗靶点。急性心肌缺血发生在AMI 时，会引起最初的促炎反应［5］，其目的是清除心肌梗死区的坏死细胞碎片，而IRI 加剧了这种促炎反应，并导致了心肌细胞死亡和心肌损伤。越来越多的实验证据表明，许多不同的参与者参与了炎症反应，它们被证明与急性心肌缺血的有害影响有关［6］，使它们成为心脏保护的重要治疗靶点。

石斛酚是一种天然存在于石斛中的1，2-二苯乙烷（联苄）。文献表明，石斛酚具有多种生物活性，如抗癌、抗氧化、抗衰老、抗凝、抗突变、抗痉挛和抗炎［7］。本文通过大鼠AMI模型，观察石斛酚对心肌梗死范围（MIS）、血清磷酸肌酸激酶（CPK）、炎症因子含量及核转录因子-kappaB（NF-κB）的影响，初步探讨石斛酚抗AMI的作用机制，为其开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

3K15台式高速冷冻离心机（Sigma）；Bio-rad垂直电泳槽和PCR 仪器；水平电泳槽等。石斛酚购自Sigma公司；CPK试剂盒购自建成生物工程研究所；白介素-1β（IL-1β）、IL-6 和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 试剂盒购自 R&D 公司；抗体 NF-κB 和 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）购自Cell Signaling公司；抗体组蛋白H1（Histone H1）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自Santa Cruz 公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 动物

雄性SD大鼠50只，质量（200±20）g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验前适应环境1周。

1.3 实验分组

将 SD 大鼠 50 只随机分为 5 组，每组 10 只，分别为假手术组、AMI 组、石斛酚高（60 mg/kg）、中（30 mg/kg）、低（15 mg/kg）给药组，采用尾静脉注射给药，假手术组和AMI 组给予等量生理盐水，每天1 次。

1.4 实验方法与观察指标

按文献方法进行AMI 造模［8］，假手术组仅置缝线而不结扎冠脉。各组分别给药治疗。全程记录心电图变化，再灌注2 h 后终止实验。以戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔麻醉，采用腹主动脉插管取血，测量血清CPK，IL-1β，IL-6，TNF-α等生化指标；取血后，分离大鼠心脏，洗净心腔，去掉心房组织及脂肪等，称质量，将左心室沿冠状面切为6 片，浸入氯化硝基四氮唑蓝（N-BT）缓冲液中，37 ℃水浴中避光孵育15 min，正常组织染色，缺血组织不染色，用缺血心肌与左心室湿重的比例计算MIS。同时，取缺血区心肌组织（假手术组取供血区心肌组织）进行后续的Western Blotting实验。

1.5 Western Blotting 法测定大鼠心肌组织中NF-κB蛋白表达

按照胞浆和核蛋白提取试剂盒方法试提取心肌组织胞浆和核蛋白。胞浆蛋白用于NF-κB 和GAPDH 的蛋白表达分析，而核蛋白用于NF-κB 和Histone H1的蛋白表达分析，采用分析软件（Image J）计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值。

1.6 数据处理及统计

数据处理结果用表示。采用SPSS 进行单因素方差分析，组间用LSD 法进行统计学差异分析，P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 石斛酚对AMI大鼠MIS及血清CPK活性的影响

模型组与假手术组相比，MIS及血清CPK活性显著增加（P<0.001），表明AMI 模型建立成功。石斛酚中、高剂量组均能显著缩小AMI 大鼠的MIS（P<0.01），而石斛酚低、中、高剂量组均能显著降低血清CPK（P<0.001）活性（见图1）。

图1 石斛酚对AMI大鼠MIS及血清CPK活性的影响

2.2 石斛酚对AMI大鼠血清炎症因子的影响

模型组与假手术组相比，血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平均显著上升（P<0.001），石斛酚中、高剂量能显著逆转AMI引起的大鼠血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平（P<0.001）（见图2）。

图2 石斛酚对AMI大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影响

2.3 石斛酚对AMI大鼠缺血区心肌组织NF-κB激活的影响

模型组与假手术组相比，AMI 大鼠缺血区心肌组织NF-κB（核蛋白）蛋白表达水平显著升高（P<0.001）。中（P<0.01）、高剂量（P<0.001）的石斛酚降低了NF-κB（核蛋白）蛋白表达水平，但是各组之间NF-κB（胞浆蛋白）蛋白表达水平没有显著升高（见图3）。

图3 石斛酚对AMI大鼠缺血区心肌组织NF-κB蛋白表达的影响

3 讨论

心肌梗死是由于冠心病所致。由于中药能整体调节机体，并具有作用广泛、安全性能高的优势，因此，中药治疗心肌梗死越来越受到重视。

MIS 和心肌特异性酶（如CPK）的存在是评价AMI 心脏损害的重要指标［9］。CPK 广泛分布于心肌细胞胞浆中，大鼠AMI 后CPK 活性明显升高。本研究表明，石斛酚能缩小AMI 模型大鼠MIS，降低CPK活性，提示石斛酚对AMI具有心脏保护作用。

急性心肌缺血发生在AMI时，会引起最初的促炎反应，其目的是清除MI 区的坏死细胞碎片。PPCI 后心肌再灌注的开始，加剧了这种促炎反应，并导致了心肌细胞死亡和心肌损伤，在促炎和抗炎修复阶段之间的平衡和过渡的紊乱都会加重急性心肌缺血，并导致MI 后不利的左室重构。AMI 后，心脏驻留细胞和循环炎性细胞分泌大量促炎细胞因子，它们通过介导炎症细胞向MI区的募集，在放大IRI的促炎症反应方面发挥着关键作用。介导AMI 后促炎症反应的主要细胞因子是IL-1β，抑制其的表达可减少MI的大小并防止不良的左室重构；IL-6发挥促炎和抗炎作用，并在IRI后释放，循环IL-6水平升高已被证明与急性冠状动脉综合征有关［10］；且研究表明坏死的心脏驻留细胞释放TNF-α和随后的NF-κB激活诱导AMI后的促炎反应［11］，并且 TNF-α，IL-1β和 IL-6 的激活受NF-κB 的调节。本研究显示，AMI 大鼠血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平显著上升，NF-κB（核蛋白）蛋白表达水平增加，表明AMI大鼠心肌NF-κB激活，继而引起炎症因子释放。

先前的证据表明，石斛酚可以抑制NF-κB 的活性，从而降低炎症介质的释放。此外，在人类肝癌研究中，发现石斛酚能够抑制NF-κB信号通路的激活，从而改善人类肝癌的进展［12］。本研究发现，石斛酚降低了AMI 大鼠缺血区心肌组织NF-κB（核蛋白）蛋白表达水平，同时改善了AMI大鼠血清炎症因子表达水平，因此，石斛酚可能通过抑制NF-κB 激活改善AMI大鼠心肌组织炎症病理过程。

综上所述，石斛酚能够减小AMI 大鼠的MIS，降低AMI 大鼠血清CPK 活性，对AMI 大鼠具有保护作用。可能是通过抑制NF-κB 信号通路的激活，进而改善了AMI 大鼠炎性反应对心肌细胞的损伤，从而改善了心脏功能。