RAGE、Hsp90AB1、TXNIP在非小细胞肺癌患者中的表达及与淋巴结转移的相关性

王莹琼, 陈建欧, 应晓媚, 李小菲, 林鹏

1温州市中医院病理科(浙江温州 325000)；2温州医科大学附属第一医院病理科(浙江温州 325000)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌80%～85%，在我国肺癌病死率占据首位，大部分患者一旦确诊已经处于晚期，主要是因为癌症病灶对患者周围血管浸润，导致远处转移，错过最佳的治疗时间，目前临床中主要采用放疗、化疗进行治疗，大部分患者预后较差[1-2]。因此及早对NSCLC诊断，对患者来说至关重要。晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)属于抑制细胞表面免疫球蛋白，维持正常组织结构和功能，参与妇科恶性肿瘤细胞增殖、转移、侵袭过程[3]。热休克蛋白90(heat shock protein,Hsp90)具有高度保守性，有助于蛋白质结构稳定，在细胞信号转导、激素应答、转录调控等过程中至关重要，调节肿瘤凋亡、增殖等，Hsp90AB1是Hsp90的一种亚型，组成性表达，在细胞长期适应性中至关重要[4-5]。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)属于一种抑癌基因，在多种恶性肿瘤中显示低表达，能抑制细胞增殖，促进凋亡，参与细胞周期介导的细胞增殖、抑制过程[6]。目前临床中缺少关于RAGE、Hsp90AB1、TXNIP三者在NSCLC中的研究。因此，本文旨在研究RAGE、Hsp90AB1、TXNIP在NSCLC患者中的表达及与淋巴结转移的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取病理科2020年5月至2021年5月行肺癌根治术切除的NSCLC 55例标本(NSCLC组)，男35例，女20例，年龄30～75岁，选取同时期病理科保存的正常组织标本36例(正常组)，男20例，女16例，年龄30～78岁，两组研究对象一般资料比较，见表1。

表1 两组研究对象一般资料比较

纳入标准：所有NSCLC患者均经过病理、影像学确诊；均符合中华医学会制定的关于NSCLC的诊断标准[7]；无化疗、放疗治疗患者；本文研究患者及其家属均知情，签署知情通知书，经过我院伦理委员会批准(2020XL0407)。

排除标准：进行化疗、放疗、免疫等治疗者；伴有其他恶性肿瘤者；伴传染性疾病者；精神异常者。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色 将保存的NSCLC病理组织厚度切片3 μm，80℃烘烤50 min，进行二甲苯脱蜡处理，使用递减梯度酒精脱二甲苯脱；在3%过氧化氢中孵育10 min，将组织中内源性过氧化物酶活性清除干净，之后采用蒸馏水清洗干净，PBS溶液浸润5 min，在微波炉中将0.01 mol/L的枸橼酸钠缓冲液加热至沸腾后将各组组织切片置入其中，给予抗原修复15 min，室温静置4 min，再次采用PBS溶液连续冲洗3次，5 min/次，滴加50 μL的一抗(RAGE(厂家：北京翘神州科技股份有限公司，货号203765-T08)、Hsp90AB1(厂家：上海科敏生物科技有限公司，货号H00003326-D01P)1∶80工作液)，4℃过夜保存。PBS连续冲洗3次，每次持续5 min；滴加羊抗鼠二抗，室温孵育10 min；再次采用PBS冲洗，DAB显色5 min，蒸馏水再次冲洗。最后苏木色复染、封片，显微镜观察RAGE、Hsp90AB1阳性表达。

免疫组化结果判定：采用双盲法，由我院经验丰富的病理科医生对免疫组化染色进行评估。根据染色数目判定[8]：0%为0分，1%～33%为1分，34%～66%为2分，67%～100%为3分。染色强度判定：0分表示无着色，1分表示淡黄色弱阳性，2分表示浅棕色中等阳性，3分表示棕褐色强阳性。以染色数目和染色强度为依据，低表达表示0～2分，高表达3～6分。

1.2.2 TXNIP基因表达检测 将NSCLC病理组织、正常组织标本置入玻璃匀浆器中，滴加5～10 mL的PBS溶液，进行充分研磨，在冰上进行，得到的匀浆通过超声破碎进行反复冻融后，置入离心机中，5 000×g离心处理5 min，提取上清液，采用实时荧光定量PCR检测：将采集到的100 μL组织上清液标本加300 μL Trizol震荡混匀静置10 min，加80 μL氯仿再次震荡混匀静置5 min，离心后凝胶离心至管底，加100 μL DEPC水。将标本混合液15 000 r/min，离心处理15 min。提取上清至液转移到含糖原EP管中，加等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃静置2 h。提取白色沉淀加1 mL的75%乙醇，混匀后充分洗涤RNA沉淀，4℃ 7 500×g，离心处理5 min，摒弃上清液。加80 μL DEPC水对RNA沉淀进行溶解，-80℃保存。采用逆转录试剂盒(TaqMan® miRNA Reverse Transcription Kit)逆转成cDNA，严格按照操作说明书进行操作。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测，采用2-ΔΔCT法对TXNIP基因表达水平分析。

2 结果

2.1 两组研究对象RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表达比较 NSCLC RAGE阳性表达为32.73%(18/55)，Hsp90AB1阳性表达为54.55%(30/55)。正常组RAGE阳性、TXNIP基因表达高于NSCLC组鳞癌、腺癌，Hsp90AB1阳性表达低于NSCLC组鳞癌、腺癌(P<0.05)。NSCLC患者鳞癌、腺癌RAGE、Hsp90AB1阳性及TXNIP基因表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表达比较 例(%)

RAGE在NSCLC组织细胞膜、细胞浆中显示棕黄色颗粒；Hsp90AB1在NSCLC组织细胞浆中显示棕黄色，弥漫分布。见图1。

注：A:正常组Hsp90AB1;B:鳞癌Hsp90AB1;C:腺癌Hsp90AB1;D:正常组RAGE;E:鳞癌RAGE;F:腺癌RAGE

2.2 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表达与NSCLC患者临床病理的关系 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表达与NSCLC患者性别、肿瘤大小、年龄无关(P>0.05)。RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表达与NSCLC患者组织分化程度、有淋巴结转移、TNM分期有关：其中低分化、有淋巴结转移、Ⅲ～Ⅳ期患者Hsp90AB1阳性表达高于中-高分化、无淋巴结转移、Ⅰ～Ⅱ期患者，低分化、有淋巴结转移、Ⅲ～Ⅳ期患者RAGE阳性、TXNIP基因表达低于中-高分化、无淋巴结转移、Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)。见表3。

表3 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表达与NSCLC患者临床病理的关系 例(%)

2.3 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP表达与NSCLC患者淋巴结转移的相关性 RAGE阳性表达与淋巴结转移呈负相关(r=-0.289，P=0.012)，Hsp90AB1阳性表达与淋巴结转移呈正相关(r=0.385，P=0.002)，TXNIP基因表达与淋巴结转移呈负相关(r=-4.112，P=0.001)。

2.4 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP对NSCLC的诊断价值 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP三者联合对NSCLC诊断敏感度、准确度高于三项单一检测，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP对NSCLC的诊断价值

3 讨论

研究显示，肺癌发病与癌细胞氧化还原平衡失调有关，受氧化应激，导致肺癌细胞快速增殖，持续刺激引起信号通路中信号传递过程受影响，细胞代谢紊乱[8-9]。TXNIP是氧化还原调节者，通过与硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)结合，促进Trx表达下调，起到抑制Trx清除活性氧的作用[10]。通过逆转录TXNIP，转染黑色素细胞，结果发现细胞凋亡与TXNIP有关，能促进黑色素细胞凋亡，抑制肿瘤生长[11]。在乳腺癌细胞中，TXNIP通过与β连环蛋白结合，参与肿瘤发展过程[12]。以上研究证实，TXNIP参与多种肿瘤发生，在肿瘤中表达降低。本文研究结果显示，TXNIP基因在NSCLC患者中显示低表达，其表达水平的高低与患者组织分化程度、有淋巴转移、TNM分期有关。提示TXNIP基因参与NSCLC患者临床病理发展过程，直接影响肿瘤进展，以及患者预后。分析TXNIP基因参与NSCLC的作用机制：TXNIP作为Trx的内源性抑制因子，通过与Trx结合，Trx表达水平下降，与凋亡信号调节激酶1(ASK1)蛋白配体结合，降低Trx-1抗凋亡能力，参与癌症发生[13]。

RAGE主要存在于肺组织细胞膜上，属于一种受体黏附分子，参与肺泡分化过程，维持正常肺泡形态[14]。已经有研究证实，RAGE水平下降会对正常肺组织形态产生干扰，导致肺部肿瘤发生，与细胞分化、凋亡有关[15]。本研究结果显示，RAGE在NSCLC中表达降低，其中低分化、有淋巴转移、Ⅲ～Ⅳ期患者RAGE阳性表达低于中-高分化、无淋巴转移、Ⅰ～Ⅱ期患者，与NSCLC临床病理特征有关。

图2 RAGE、Hsp90AB1、TXNIP对NSCLC的诊断价值(ROC曲线)

李洋等[16]在相关研究中指出，RAGE在肺癌组织中表达降低，与患者TNM分期、淋巴结转移有关，与本研究结果一致。RAGE参与NSCLC可能机制：RAGE胞内端可与下游信号分子DIAPH1结合，促进RAGE-DIAPH1复合体形成，胞外配体对RAGE刺激作用不断提高，参与NSCLC疾病进展过程[17]。本研究结果显示，NSCLC组鳞癌、腺癌Hsp90AB1阳性表达低于正常组，且鳞癌、腺癌Hsp90AB1阳性表达比较无差异。本研究中，Hsp90AB1表达与NSCLC组织分化程度、有淋巴转移、TNM分期有关，参与NSCLC疾病发展过程。刘俊雅等[18]发现，Hsp90在胰腺癌组织中显著高表达，与肿瘤病理分级、淋巴结转移、临床分期、TNM分期有关，与胰腺癌高侵袭、高转移疾不良预后相关，因此Hsp90可能作为肺癌预后独立危险因素的重要指标。与王明慧等[19]研究中肺腺癌组织中的阳性表达高于肺鳞癌结果不一致，可能是因为本研究样本量有限。EGFR突变在肺腺癌发病中占较高比重，且EGFR作为Hsp90AB1底物蛋白，参与肺癌发病过程[20-21]。

经过Pearson相关性分析发现，RAGE阳性、TXNIP表达与淋巴结转移呈负相关，Hsp90AB1阳性表达与淋巴结转移呈正相关，提示随着NSCLC淋巴结转移，RAGE、TXNIP表达逐渐降低，Hsp90AB1表达升高，参与NSCLC发病进展。RAGE、Hsp90AB1、TXNIP三者联合检查敏感性、准确度较高，从而提高NSCLC诊断价值。

综上所述，RAGE、Hsp90AB1、TXNIP在NSCLC中表达异常，三者与NSCLC患者淋巴结转移具有相关性，参与疾病发展，三者联合检查对NSCLC诊断价值较高。

利益相关声明：所有作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明：王莹琼：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写与修改；陈建欧：提出研究思路，分析试验数据，论文审核;李小菲：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;应晓媚：进行统计学分析;林鹏：课题设计，论文修改，资料收集整理。