电针通过Toll样受体信号通路调控细胞因子减轻脓毒症免疫抑制的作用及其机制

孙芳园，耿 欢，卢 明，周嘉奕，雷 鸣

(上海中医药大学附属第七人民医院，上海 200137)

脓毒症是由感染诱导的全身炎症反应综合征，是患者进入重症监护室的重要病因。及时控制感染、减轻患者机体高强度炎症反应，纠正酸碱失衡循环障碍等是挽救患者生命的关键内容[1]。虽然现代医学已经取得了很大进展，但脓毒症的发病率仍然在上升，严重的脓毒症和脓毒休克是目前危重病患者死亡的主要原因，其死亡率高达28%～50%[2]。现已证实脓毒症的发生发展与免疫功能紊乱有关，并可进一步引起机体器官功能衰竭；而胆碱能抗炎途径是近年来发现的一种胆碱能神经及其递质调节或对抗全身炎症反应的途径[3]。相关研究结果表明，迷走神经兴奋胆碱能抗炎途径可明显抑制由内毒素和失血引起的促炎因子的释放及全身炎症反应，因此，该途径对于脓毒症的治疗意义重大[4]。伴随着中医技术的不断发展，传统的中医疗法也逐渐被用于治疗脓毒症，中医针刺对机体免疫具有双向调节作用，对提高机体免疫功能、防止感染和过敏性疾病、抗肿瘤等有很大的应用价值，但是临床上认为电针治疗脓毒症的机制可能是通过抗炎、调节免疫功能和保护脏腑功能实现的。Toll样受体(Toll—like receptors，TLRs)家族能有效地识别病原体，参与机体免疫反应，有研究表明[5]，TLRs信号通路异常激活是脓毒症发生和发展的重要原因[6]。TLR4能识别多种类型的微生物，涉及到革兰阴性菌、阳性菌、分枝杆菌、螺旋体以及某些病毒的免疫应答。其中，脂多糖是革兰阴性杆菌细胞壁的主要成分，它能被免疫系统的模式识别受体所识别，并能刺激多种炎性介质的释放，导致全身性炎症反应综合征[7]。相关研究发现，机体在感染革兰阴性杆菌后，粗面脂多糖先结合到血清脂多糖结合蛋白上，再结合到细胞表面的CD14分子上，将TLR4/MD2与脂多糖结合蛋白-CD14三体复合物传递给TLR4/MD2，最终活化TLR4信号传导；而光面脂多糖则与TLR4直接相互作用，激活信号传导，提示TLR4对脓毒症的发病起着重要作用[8-9]。为探究针灸是否能通过TLRs信号通路调节脓毒症病情，本研究开展如下研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验大鼠 由上海中医药大学动物实验中心提供。56只SPF级SD雄性大鼠，10周龄，体质量(200±20)g。实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2015～0001。

1.1.2 主要仪器 美国BD公司流式细胞仪;德国Eppendorf公司RS232C型核酸测定仪;上海安亭科学仪器DDL-5冷冻离心机;德国Eppendorf公司5804R型低温超速离心机;血细胞分析仪。

1.1.3 主要试剂 Total RNA提取试剂(No.D312)、RT-PCR试剂盒购自Thermo公司;RNase-free引物均购自RaKaRa公司；免抗鼠TLR4及NF-κΒ多克隆抗体为美国Santa Cruz公司提供;肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒、白介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA试剂盒均购自上海西塘试剂公司。

1.2 脓毒症大鼠模型建立

选择成年雄性SD大鼠，体质量250 g左右，任意选取8只不做任何处理，正常饲养，作为空白对照组，48只大鼠采用盲肠结扎穿孔术(Cecal ligation and puncture，CLP)制备脓毒症模型。具体制备方式：采用20 g/L戊巴比妥钠麻醉试验大鼠，麻醉满意后，沿大鼠腹正中线作一1.5 cm长切口，盲肠根部结扎盲肠，18号针反复3次穿通盲肠，形成盲肠漏，留置橡皮引流条用以贯通盲肠，以防针孔闭合。处理完毕后，将盲肠放置回腹腔，逐层缝合腹壁切口。

1.3 实验大鼠干预方法

采用随机数字表法将48只脓毒症模型大鼠均分为电针组与假电针组。其中电针组大鼠按照《实验针灸学》《大鼠穴位图谱的研制》中所提供的方法找到大鼠双侧足三里穴及关元穴，进行电针刺激治疗。大鼠双侧足三里穴定位于膝关节外后侧，腓骨小头下5 mm处，关元穴位于大鼠腹部脐下约25 mm处，脐平双髂脊连线中点。找准穴位后适当标注，直刺5～7 mm，电刺激频率为4～20 Hz，脉冲密度0.5 ms、强度1 mA，连续刺激30 min，1次/d。连续干预3 d。假电针组大鼠进行非经非穴刺激，选择足三里穴外侧旁开0.5 cm处及关元穴外开0.5 cm处，给予相同频率及强度的电刺激，连续干预3 d。

1.4 观察指标

1.4.1 各组大鼠外周血单核细胞内TLR4及NK-κΒ表达 ①采用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，加入1 mL Trizol静置10 min裂解，然后加200 μL氯仿，上下颠倒混匀15 s，室温静置5 min，12 000 rpm离心5 min，然后取上层水相中的液体于无RNA酶EP管中(勿取下层红色液体)，加入预冷异丙醇500 μL，上下颠倒混匀，-20 ℃放置1 h，再存放于4 ℃，12 000 rpm离心15 min，弃上清液，加入1 mL预冷的75 %乙醇洗涤，4 ℃，12 000 rpm，离心15 min，去上清液，重复两次，待出现白色RNA时加10 μL DEPC水，放于58 ℃助溶5 min，将已提取出的RNA取1 μL用Nanodrop 2000进行浓度和纯度检测，然后放于-80 ℃保存待用；②利用Thermo Fermentas反转录试剂盒的说明书操作步骤进行RNA反转录，分别取RNA 2 μg，Oligo(dT)1 μL，DEPC 8 μL；在PCR仪进行65 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min反应，最终得到产物即为目的cDNA，放于-20 ℃保存待用；③TLR4及NF-κΒ(Nuclear factor kappa binding,NF-κΒ)mRNA相对表达量。通过核酸蛋白检测确定总RNA纯度与浓度，若纯度比值在1.8～2.0间认为纯度适合。其中引物序列：TLR4：5′-TGCTCAGACATGGCAGTTTC-3′，5′-TCAAGGCTTTTCCATCCAAC-3′;NF-κΒ：5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′，3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5′。取总cDNA、上游和下游引物各1 μL，加入试剂盒其他成分。反应条件为：95 ℃保持5 min，94 ℃保持30 s，55～65 ℃保持30 s，72 ℃保持1 min，40个循环扩增；在延伸过程中收集荧光。

1.4.2 各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群占比 采用流式细胞术检测外周血T淋巴亚群CD3+、CD4+及CD8+表达水平。取大鼠尾静脉血液2 mL，放于EDTA-K2抗凝真空采血管内，然后取两个流式专用管，其中一个装入待测标本，另一个加入CD4-FITC/CD8-PE/CD3-APC，再加入全血100 μL，混匀。放置在室温下，避光孵育15 min，加入FACSL血液2 mL，放置在室温，避光孵育10 min，300 g离心5 min，弃上清液。PBS洗涤细胞两次，300 g离心5 min，弃上清液。最后上机检测，分析结果。

1.4.3 各组大鼠外周血炎症因子水平 参照ELISA试剂盒说明书，用包被缓冲液稀释血清抗原至最适浓度，取100 μL加于微反应板孔中，4 ℃过夜或37 ℃水浴2～3 h。移去包被液，板孔用洗涤缓冲液洗3次，5 min/次。每孔加入100 μL一定稀释倍数的被检血清，37 ℃作用1～2 h加入待检样品及后续试剂。洗涤去掉游离未结合反应物，每孔加入稀释缓冲液稀释的酶结合物100 μL，37 ℃作用1～2 h。加入酶检测底物50 μL，温育30 min后洗涤，再先后加入显色剂A 50 μL、显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加入100 μL生物素化的抗人TNF-α、IL-6抗体，终止反应(蓝色立转黄色)后15 min内以空白孔调零，用酶标比色计(芬兰雷勃公司)450 nm测定吸光度(OD)，计算标准曲线检测TNF-α、IL-6浓度。

1.4.4 各组大鼠中性粒细胞与淋巴细胞比值(Neutrophils lymphocytes ratio,NLR) 血球分析仪进行血常规检查，应用电阻法和激光计数法的原理，对白细胞进行分类计数，计算NLR。取一小滴(米粒大小)大鼠静脉血置于干净玻片上的一端；用干净推玻片的一端放在血滴前方，将推玻片略微向后移动，使其与血滴接触，让血滴在载玻片的夹角之间平均分散，然后用30 °～45 °角不加压力，平稳地推至另一端，制成均匀的血膜薄片；将血片干后，滴上瑞氏染液，使盖满整个血膜片，约半分钟后再加一倍蒸馏水，轻摇玻片，待5～10 min后，用净水缓洗去染液，洗净后用玻片上的染玻片，洗去染边溢出，以免染边溢出。先在低倍镜下观察染好晾干的血片的细胞染色和分布情况，然后用油镜进行分类，分类时要按一定的顺序；将所见的细胞分别记下，直至总数100个，计算各类细胞所占的百分比。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 3组大鼠外周血PBMC表面TLR4表达水平

对比3组大鼠外周血PBMC表面TLR4表达水平，发现电针组及假电针组大鼠外周血TLR4表达水平均显著高于空白对照组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)，且电针组大鼠外周血TLR4水平显著低于假电针组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠外周血PBMC表面TLR4表达水平

2.2 3组大鼠TLR4表面NK-κΒ mRNA相对表达量比较

对比3组大鼠TLR4表面NK-κΒ mRNA相对表达量，发现电针组及假电针组大鼠外周血TLR4表面NK-κΒ mRNA相对表达量均显著高于空白对照组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)，但电针组大鼠外周血TLR4表面NK-κΒ mRNA相对表达量显著低于假电针组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

表2 3组大鼠TLR4表面NK-κΒ mRNA相对表达量比较

2.3 3组大鼠外周血T淋巴细胞亚群比较

对比3组大鼠外周血T淋巴细胞亚群，发现电针组及假电针组大鼠外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均显著低于空白对照组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)，3组CD8+水平无显著性差异(P>0.05)，但电针组大鼠外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均显著高于假电针组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠外周血T淋巴细胞亚群比较

2.4 3组大鼠外周血炎症因子及NLR水平比较

对比3组大鼠外周血炎症因子及NLR水平，发现电针组及假电针组大鼠外周血TNF-α、IL-6及NLR水平均显著高于空白对照组大鼠，差异具有统计学意义(P<0.05)，但电针组大鼠外周血TNF-α、IL-6及NLR显著低于假电针组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 3组大鼠外周血炎症因子及NLR水平比较

3 讨论

脓毒症大多由于宿主自身对外界感染造成的一种失控免疫反应，导致器官出现功能性障碍，其作为前急危重症病人死亡的主要诱因，也是目前威胁人类生命的最主要的问题之一[10]。根据流行病学调查结果，脓毒性休克患者病死率达40 %以上，其致死机制多种多样，心肌抑制是引起机体血流动力学恶化的重要原因，而脓毒症能够诱发心肌损伤、心肌抑制，最终造成死亡[11]。

Toll样受体属于Ⅰ型跨膜受体家族，是机体的固有免疫受体，TLR4是该家族中最重要的模式识别受体，TLR4能识别多种微生物，参与多种病原菌的免疫反应。孙姗姗等[12]研究发现，TLR4及c-Jun氨基末端(JNK)信号通路被激活后可导致炎症反应及细胞凋亡，证实TLR4相关信号通路参与脓毒症心肌损伤。孙雪东等[13]研究发现，抑制TLR4相关信号通路可缓解脓毒症所致的大鼠肺损伤，并减少相关炎症因子的释放，进而缓解脓毒症大鼠病情。大量研究亦证实，TLR4能通过髓样分化蛋白88(Myeloid differentiation factor88,MyD-88)依耐性反应通路及非MyD-88依耐性反应通路，激活淋巴细胞，促进促炎性因子释放，上调刺激信号因子，进而参与脓毒症的发生及发展[14-15]。以上研究均证实，TLR4相关信号通路是脓毒症发生与发展的重要通路。

临床上脓毒症以革兰阴性杆菌感染为主，TLR4作为革兰阴性杆菌及其产物识别的关键因子，也是连接内在免疫和获得性免疫的桥梁。当发生脓毒症时，所释放的毒素和发炎介质都能作用于机体的免疫系统，从而激活TLR4的信号传导功能，引起一系列的信号传递，如TNF-α、IL-6及IL-8等促炎细胞因子的释放，这些毒素和发炎介质再一次激活机体的免疫系统，两者互为因果，导致炎症介质过度释放，最终导致脓毒症。所以，如何影响TLR4的表达以及下游信号通路的传导成为脓毒症治疗的关键[16]。当前，有关TLR4与脓毒症免疫抑制相关的研究主要是通过各种干预措施来切断脓毒症的反应链，从而减轻脓毒症引起的机体损伤，改善预后[17]。张烈等[18]亦发现经血液滤过治疗后，脓毒症患者的血中炎性因子水平和外周血单核细胞TLR4 mRNA、TLR4miRNA-146a表达发生了显著变化，与治疗前相比，外周血单核细胞TLR4miRNA-146a表达水平明显降低，且预后良好。陈欣等[19]通过分析乌司他丁对脓毒症大鼠Toll样受体4表达的影响及其机制，结果发现与对照组比较，乌司他丁作用下的脓毒症大鼠的TLR4和NF-KB水平明显下降，且心肌损伤程度明显改善。Kim SJ等[20]观察干燥花蕾提取物HS-23对脓毒症大鼠肝脏、肺组织中TLR4蛋白、TLR4 mRNA的表达的影响，结果表明，HS-23对TLR4 mRNA的表达有抑制作用，血清中各种炎性细胞因子水平下降，脓毒症小鼠脓毒症小鼠的细菌清除率提高，脓毒症引起MODS增加。上述试验进一步证实TLR4参与脓毒症的形成和发展。降低TLR4的表达，阻断TLR4在细胞内的信号传导，可以降低毒素和炎性介质的释放，从而阻断炎症反应链，改善预后。

随着临床医疗技术的不断提高，脓毒症患者感染控制情况及最终存活率较以往得到明显提高，但依旧有一部分脓毒症患者经常规治疗干预后无效。为响应国家号召，中医学近年来逐渐应用于临床多种疾病的治疗，脾胃是中焦,为全身脏腑功能的枢纽，在现代研究中，脾胃功能失调与脓毒症有密切的关系。足三里与足阳明胃经合穴，是调整胃肠功能的穴位，该穴位有调节脾胃清浊、气机升降和阴阳调和的作用，使大便自通，毒邪随之而去[21]。由于免疫功能紊乱是脓毒症致病机制中重要的组成部分，通过电针刺激与免疫相关的足三里穴与关元穴可能在促进脓毒症康复中具有积极意义。此外，电针是神经电刺激与中医针灸的结合，电针疗法在中医毫针的基础上，使用脉冲发生器，通过毫针对应穴位进行持续稳定、精确且可控的电刺激治疗[22]。

本研究采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型后将其均分为两组，并分别对两组脓毒症大鼠进行电针刺激足三里穴及关元穴治疗及假电针刺激，干预3 d后，采集实验大鼠外周血，检测发现，与空白对照组大鼠相比，脓毒症模型大鼠外周血PBMC表面TLR4表达水平及NK-κΒ mRNA相对表达量均明显上升，且脓毒症模型大鼠炎症因子TNF-α、IL-6等炎症因子也大量释放，提示脓毒症大鼠TLRs/NK-κΒ信号途径异常活化，该途径通过释放大量炎症细胞因子促进脓毒症的发生及发展。这可能是因为足三里穴是足阳明胃经合穴，刺激该穴位能治虚劳证，而关元穴为人体元气之根本，刺激该穴能振奋肾气，调节机体免疫网络[23]。早期临床研究发现电针足三里可改善脓毒症病人早期出现目标性肠道通应。通过胆碱能途径，可阐释电针足三里抑制炎症反应及保护脏器的作用机制，即兴奋副交感胆碱能神经，抑制交感胆碱能神经。用电针刺激足三里穴可显著降低脓毒症大鼠促炎因子的水平，二胺氧化酶活性可减轻肠组织水肿及功能损害，而对抗炎因子的水平无明显影响，而用电针前切断双侧迷走神经干可显著降低电针的抗炎及保护作用[24]。与此同时，脓毒症模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群占比也发生了明显的改变，其CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明显降低，提示机体免疫力明显降低，存在免疫抑制现象。但研究表示，与假电针治疗组的脓毒症大鼠相比，经电针刺激足三里穴及关元穴的脓毒症模型大鼠外周血TLR4、NK-κΒ mRNA相对表达量及细胞炎症因子水平均明显下降，NLR水平也明显降低，其中NLR是一种检测便捷的炎症指标。此外，T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平较假电针组明显上升，以上研究结果提示，电刺激治疗可能通过调整TLR4/NK-κΒ信号通路、减少炎症因子的释放和减轻机体免疫抑制，帮助脓毒症康复。但脓毒症致病机制复杂，其相关的信号通路较多，本研究受限于实验条件，仅对电针疗法对TLR4/NK-κΒ信号通路的影响进行了研究，虽最终证实电针疗法可通过TLR4/NK-κΒ信号通路调节脓毒症模型大鼠机体炎症反应及免疫功能，但这可能不是电针治疗脓毒症的唯一作用机制。

综上所述，电针刺激足三里穴与关元穴可能通过TLR4/NK-κΒ信号通路减少炎症因子的释放并减少免疫抑制，促进脓毒症康复。