野生藤茶资源的鉴别及指纹图谱评价

张朝阳,马世龙,秦邦,向班贵,胡百顺*,陈永波,刘瑶,陈娥

野生藤茶资源的鉴别及指纹图谱评价

张朝阳1,马世龙1,秦邦1,向班贵2,胡百顺1*,陈永波1,刘瑶1,陈娥1

1. 恩施土家族苗族自治州农业科学院, 湖北 恩施 445000 2. 恩施州凤鸣藤茶有限公司, 湖北 恩施 445000

为建立藤茶资源植物形态、显微、薄层色谱鉴别方法，评价筛选出推荐资源，本研究以收集栽种的13个野生藤茶资源为研究对象，通过比对植物形态特征、粉末显微特征、薄层色谱特征斑点、指纹图谱相似度进行鉴别，同时利用指纹图谱比对的10个共有峰，进行相关性分析、主成分分析、聚类分析。结果表明：13个野生资源均为显齿蛇葡萄（），但不同资源间植物形态、薄层色谱、指纹图谱有所差异；显齿蛇葡萄快速分类检索包含了蛇葡萄属植物分类要点；各资源粉末显微特征差异较小；各资源薄层色谱相应位置斑点基本一致，但颜色深浅有所不同；主成分分析共提取3个主成分，方差累计贡献率91.583%，同时建立资源评价模型=0.577791+0.219762+0.118273；聚类分析将13个资源聚为4类，类群III评分最高，类群IV评分最低。评价筛选出贵州江口、江西定南、广西三江野生藤茶资源作为推荐资源。

野生藤茶; 植物形态; 指纹图谱

藤茶，是由葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄[(Hand.-Mazz.)W. T. Wang]嫩茎叶制成的代用茶，俗称莓茶、藤婆茶、龙须茶、神仙草等，在我国长江流域以南的多个省区广有分布。藤茶在《全国中草药汇编》、《救荒本草》、《中华本草》等中医古籍中多有记载，并于2013年被国家卫计委批准成为新食品原料，是一种典型的药食两用植物资源，素有“三两黄金一两茶”的美誉，现已成为湖北恩施、湖南张家界等地特色产业。

目前，藤茶相关研究主要集中在抗氧化活性、二氢杨梅素测定、药理作用等方面[1-7]，质量标准、指纹图谱等方面也有所报道。石依姗[8]、李瑛琦[9]、刘俊奇[10]等对藤茶进行了质量标准研究，初步建立了藤茶质量标准，刘建新[11]、曾祥燕[12]等对藤茶进行了植物形态、粉末显微、薄层色谱等生药学鉴别，汪秋兰[13]、范莉[14]、苏素娇[15]等对藤茶进行了指纹图谱研究并建立了相关评价模式。

藤茶评价研究多以异地或本地收集样品为研究对象，未发现异地野生资源本地栽种评价的相关研究。本研究将收集的各省份野生藤茶资源引进栽种后对资源进行评价，避免了先评价产品后引进资源最终不适宜本地推广栽种的弊端，同时利用生药学手段对野生藤茶资源进行植物形态、显微、薄层色谱、指纹图谱鉴别，利用主成分分析和聚类分析对指纹图谱相关数据进行分析评价，最终筛选出推荐资源，以期对藤茶特色产业可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

恩施州农科院2018-2020年从湖南张家界、贵州江口、湖北恩施、重庆酉阳、福建长汀等地收集13个野生藤茶资源，当年扦插于湖北省来凤县大河镇两河口村藤茶基地资源圃，编号T1-T13，按照《藤茶生产技术规程》[16]标准化种植管理，2021年7月采摘嫩叶，采摘后24 h内蒸汽杀青2 min，50 ℃烘干，粉碎、过40目筛，密封避光保存，样品信息见表1。

表 1 野生藤茶资源样品信息

二氢杨梅素（源叶生物，Y25A6K1）；杨梅素（源叶生物，YM0311YA13）；杨梅苷（源叶生物，DO1031EA14）；花旗松素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，D2014038）。

1.2 仪器设备

UltiMate 3000高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技公司）；EX31生物显微镜（宁波舜宇仪器有限公司）；SQP分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；BGZ-240恒温干燥箱（上海博讯仪器有限公司）；SB-5200超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；H1850离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；PCDX-W-10超纯水器（成都品成科技有限公司）；G型硅胶板（青岛海洋化工有限公司）；C18色谱柱（Kromasil，4.6 mm×250 mm/5 μm）。

1.3 试验方法

显微、薄层色谱鉴别：参照《中国药典》[17]执行。

指纹图谱：参照汪秋兰等[13]的方法测定。

1.4 数据分析

数据经Excel 2003初步处理后，采用SPSS 22.0软件进行相关性分析、主成分分析、聚类分析，指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012进行相似度评价。

2 结果与分析

2.1 植物形态鉴别

石依姗等[18]通过文献考证和资源调查，确认藤茶植物基原为葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄。本研究根据《中国植物志》[19]葡萄科蛇葡萄属植物形态特征，建立显齿蛇葡萄快速鉴别分类检索。

1叶为单叶，叶片不裂或不同程度3-5裂，但不深裂至基部成全裂片…… 尖齿蛇葡萄、蓝果蛇葡萄等

1叶为掌状复叶或羽状复叶………………………………………………………………………………… 2

2叶为3-7掌状复叶………………………………………………………… 三裂蛇葡萄、乌头叶蛇葡萄等

2叶为羽状复叶……………………………………………………………………………………………… 3

3小枝、叶柄和花序轴被长柔毛或短柔毛…………………………………… 广东蛇葡萄、毛枝蛇葡萄等

3小枝、叶柄和花序均无毛………………………………………………………………………………… 4

4叶干时两面不同色，上深下浅，小叶边缘全缘或有细锯齿………………… 羽叶蛇葡萄、粉叶蛇葡萄

4叶干时两面同色，小叶边缘有明显粗锯齿……………………………………………………………… 5

5卷须3分枝；小叶片较大，长4-12 cm，宽2-6 cm………………………………………… 大叶蛇葡萄

5卷须2叉分枝；小叶片较小，长2-5 cm，宽1-2.5 cm…………………………………… 显齿蛇葡萄

由此可知，显齿蛇葡萄形态特征为：羽状复叶，小枝、叶柄和花序均无毛，叶干时两面同色、小叶边缘有明显粗锯齿，卷须2叉分枝，小叶片较小，长2～5 cm、宽1～2.5 cm。观察记录收集的13个野生藤茶资源植物形态特征并与显齿蛇葡萄快速分类检索进行比对，两者基本相符，但不同资源间小叶片大小、数目、边缘锯齿数等有所不同，说明收集的13个野生藤茶资源均为显齿蛇葡萄，但资源间形态特征有所差异，引进栽种的显齿蛇葡萄见图1。

图1 显齿蛇葡萄

2.2 显微鉴别

图 2 藤茶粉末显微图

注：A. 草酸钙针晶；B. 螺纹导管；C. 梯纹导管；D. 栅栏组织碎片

Note: A. acicular crystal; B. threaded conduit; C. ladder catheter; D. palisade tissue fragment

利用水合氯醛透化法制作临时装片，发现各资源粉末显微特征差异较小，如图2所示：粉末呈绿色、棕色不等；草酸钙针晶多见，长40～80 μm，成束或散在；草酸钙簇晶多见，直径15～30 μm；螺纹导管多见，梯纹导管可见；单细胞非腺毛可见，长30～65 μm；纤维可见，壁平直或弯曲，具隔；栅栏组织碎片可见；气孔可见，为不定式；淀粉粒可见、多为单粒。

2.3 薄层色谱鉴别

参考曾祥燕等[12]色谱条件并根据实际情况进行优化：取样品粉末1 g，加甲醇10 mL，摇匀，密封避光冷浸12 h，滤过，取续滤液稀释2倍即为供试品溶液。另取杨梅苷、二氢杨梅素、花旗松素对照品，分别加甲醇制成浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液。按照《中国药典》[17]规定，用点样毛细管吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一G型硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-氯仿-甲酸（5:4:1，体积比）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%三氯化铁乙醇溶液，日光灯下检视。结果表明，藤茶供试品色谱主要斑点分离度较好，无明显重合，供试品色谱在与对照品色谱相应位置上均显示相同颜色斑点，易混品色谱在相应位置无斑点显现，说明薄层色谱条件良好；各供试品色谱相应位置斑点基本一致，颜色深浅有所不同，T3、T5供试品色谱在二氢杨梅素相应位置斑点明显淡于其他供试品色谱，说明13个供试品为同一植物资源，但各资源间黄酮类物质含量有所不同，详见图3。

图 3 藤茶薄层色谱图

注：1-3. 对照品杨梅苷、二氢杨梅素、花旗松素；4-16. 供试品T1-T13；17-18. 同科易混品

Note: 1-3. myricitroside, dihydromyricetin, taxifolin; 4-16. test samples T1-T13; 17-18. samples of the same family

2.4 指纹图谱

参照汪秋兰等[13]的方法测定指纹图谱，将13个野生藤茶资源的指纹图谱转成CDF格式，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012，以T1为参照图谱，经多点校正、全谱峰匹配，共确定10个共有峰，与对照品色谱图比对，由图4可知：3号峰为二氢杨梅素、5号峰为花旗松素、7号峰为杨梅苷、8号峰为杨梅素，且供试品二氢杨梅素峰面积、峰高远远大于其他色谱峰。

图4 藤茶指纹图谱

注：S1. 供试品；S2. 对照品；3. 二氢杨梅素；5. 花旗松素；7. 杨梅苷；8. 杨梅素

Note: S1. test sample; S2. reference substance; 3. dihydromyricetin; 5. taxifolin; 7. myricitroside; 8. myricetin

2.4.1 相似度评价以全谱峰匹配的10个共有峰生成对照图谱，计算相似度，发现13个野生藤茶资源的相似度在0.995～1.000之间，说明各资源间具有较好的相似度，成分组成基本一致，各资源指纹图谱见图5。考虑到各资源二氢杨梅素峰面积均远高于其他色谱峰，二氢杨梅素峰面积可掩盖各资源其他色谱峰之间的差异性，因此以屏蔽二氢杨梅素峰后的9个共有峰生成对照图谱，计算相似度，发现13个野生藤茶资源的相似度在0.746～0.999之间，且除T3、T5相似度分别为0.746、0.800外，其他资源相似度均在0.988以上，说明除T3、T5外，其他各资源无论是全谱峰还是屏蔽二氢杨梅素后的色谱峰均具有较好的相似度，T3、T5屏蔽二氢杨梅素后的色谱峰与其他资源间有较大差异。

图 5 藤茶资源叠加色谱图

2.4.2 描述性分析将13个藤茶资源指纹图谱共有峰峰面积导入Excel 2003，计算平均值、标准偏差、变异系数，由表2可知，10个色谱峰峰面积变异系数在25.04%～47.79%之间，变异系数均大于20%，说明藤茶资源各共有成分含量差异较大。

表 2 藤茶资源指纹图谱共有峰描述性分析

2.4.3 相关性分析将13个藤茶资源指纹图谱共有峰峰面积导入SPSS 22.0软件进行相关性分析，由表3可知，峰3与峰4、峰3与峰5、峰3与峰6、峰3与峰9、峰4与峰5、峰4与峰6、峰4与峰9、峰5与峰6、峰5与峰9、峰6与峰9、峰7与峰10呈极显著正相关（＜0.01）；峰3与峰7、峰3与峰10、峰4与峰7、峰4与峰10、峰5与峰7、峰5与峰10呈极显著负相关（＜0.01）；峰1与峰8、峰6与峰7、峰6与峰10、峰7与峰9、峰9与峰10呈显著负相关（＜0.05）。

表 3 藤茶资源指纹图谱共有峰相关性分析

注：*在0.05水平显著相关；**在0.01水平极显著相关。

Note: *significant correlation at＜0.05; **extremely significant correlation at＜0.01.

2.4.4 主成分分析将藤茶资源指纹图谱共有峰峰面积导入SPSS 22.0软件进行主成分分析，根据特征值大于1的原则，共提取出3个主成分，由表4可知，3个主成分特征值分别为5.778、2.198、1.183，主成分方差贡献率分别为57.779%、21.976%、11.827%，累计贡献率91.583%，大于85%，可解释藤茶成分的大部分信息，因此选择前3个主成分对藤茶进行综合评价。

根据载荷系数绝对值大于0.8的原则，由表4可知，对主成分1影响较大的峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰9、峰10，其中峰3、峰4、峰5、峰6、峰9具有较大正载荷量，峰7、峰10具有较大负载荷量；对主成分2影响较大的是峰1，具有较大负载荷量；对主成分3影响较大的是峰2，具有较大正载荷量。

表 4 主成分向量载荷系数、特征值和方差贡献率

利用SPSS 22.0软件对色谱峰峰面积进行标准化处理，结合表5中主成分特征向量可得主成分回归方程：

1=0.0411+0.0272+0.1703+0.1584+0.1595+0.1476-0.1567-0.0048+0.1459-0.15710

2=-0.4041-0.2032+0.0393+0.1004+0.0965+0.0966+0.1717+0.3538+0.1839+0.18110

3=0.0811+0.7332-0.0863-0.0854+0.1155-0.0016+0.0467+0.5208-0.0409-0.01010

以各主成分对应的方差贡献率为权重，得出藤茶资源综合评价模型表达式为：=0.577791+0.219762+0.118273

由评价模型计算出藤茶资源各主成分得分、综合得分、排名，由表6可知，13个藤茶资源综合得分及排名依次为T1、T4、T8、T2、T12、T7、T9、T13、T10、T11、T6、T5、T3。

表 5 主成分特征向量

表 6 藤茶资源综合得分及排名

2.4.5 聚类分析将藤茶资源指纹图谱共有峰峰面积导入SPSS 22.0软件，标准化处理后进行聚类分析，聚类方法采用瓦尔德法，聚类区间为平方欧式距离，结果见图6。

由图6可知，当欧式距离为4时，可将13个藤茶资源聚为4大类群，类群I有4个藤茶资源，分别为T8、T9、T11、T13，类群II有4个藤茶资源，分别为T6、T7、T10、T12，类群III有3个藤茶资源，分别为T1、T2、T4，类群IV有2个藤茶资源，分别为T3、T5。

对各类群藤茶资源色谱峰峰面积计算平均值和变异系数，由表7可知，类群I中藤茶资源各峰面积居中，但峰1、峰2峰面积高于其他类群，峰7、峰10峰面积低于其他类群；类群II中藤茶资源各峰面积居中，但峰2、峰8峰面积低于其他类群；类群III中藤茶资源峰3、峰4、峰5、峰6、峰8、峰9峰面积高于其他类群，峰1峰面积低于其他类群；类群IV中藤茶资源峰7、峰10峰面积高于其他类群，峰3、峰4、峰5、峰6、峰9峰面积低于其他类群。同时由各类群共有峰峰面积变异系数可知，除类群I中峰1、峰8，类群II中峰10，类群III中峰6、峰8，类群IV中峰1、峰3、峰5、峰6外，其余共有峰峰面积变异系数均小于20%，其中类群IV中有4个色谱峰峰面积变异系数大于20%，主要是由于类群IV只有T3、T5两个样本，样本数量少导致的，所以聚类分析划分的四个类群基本合理。

图 6 藤茶资源聚类分析图

表 7 不同类群藤茶资源色谱峰特征

3 讨 论

野外资源调查时，往往需要比较明显的形态特征作为参考依据来确定植物种类[20]，本研究建立了显齿蛇葡萄快速分类检索，可大大提高野外鉴别显齿蛇葡萄的效率。

显齿蛇葡萄富含黄酮类物质，被誉为植物界的“黄酮之王”，张学英[21]发现藤茶中总黄酮含量高达300～400 g/kg，二氢杨梅素含量占总黄酮含量的70～80%，从本研究薄层色谱图可明显观察到供试品二氢杨梅素斑点颜色远远深于其他斑点，藤茶资源T3、T5二氢杨梅素斑点颜色浅于其他资源，结合指纹图谱共有峰主成分分析，二氢杨梅素含量最高的资源T1综合排名第1，二氢杨梅素含量较低的资源T3、T5综合排名最后，表明二氢杨梅素含量是决定藤茶品质的重要指标，这与其他相关研究具有较好的一致性。

指纹图谱能比较全面地反应研究对象物质组成及各物质间量化关系，本研究指纹图谱相似度评价发现，10个共有峰相似度在0.995～1.000之间，屏蔽二氢杨梅素峰后的相似度在0.746～0.999之间，且除T3、T5相似度分别为0.746、0.800外，其他资源相似度均在0.988以上，同时共有峰峰面积变异系数表明10个色谱峰峰面积变异系数均大于20%，说明不同藤茶资源物质组成基本一致，但共有成分含量差异较大，这与范莉等[14]、苏素娇等[15]的研究基本一致。

对藤茶资源指纹图谱的10个共有峰进行主成分分析和聚类分析，共提取出3个主成分，方差累计贡献率91.583%，根据特征向量和方差贡献率构建评价模型：=0.577791+0.219762+0.118273，模型得分由高到低依次为T1、T4、T8、T2、T12、T7、T9、T13、T10、T11、T6、T5、T3；聚类分析将藤茶资源聚为4类，类群I和类群II均为武陵山区野生藤茶资源，类群I资源峰1、峰2峰面积高于其他类群，峰7、峰10峰面积低于其他类群，类群II资源峰2、峰8峰面积低于其他类群，类群III资源峰3、峰4、峰5、峰6、峰8、峰9峰面积高于其他类群，峰1峰面积低于其他类群，整体评分最高，故作为推荐资源，即贵州江口、江西定南、广西三江野生藤茶资源，类群IV为东南沿海野生藤茶资源，峰7、峰10峰面积高于其他类群，峰3、峰4、峰5、峰6、峰9峰面积低于其他类群，整体评分最低，可能是由于产地环境与武陵山区差异较大引起的[22]。

4 结 论

本研究建立了显齿蛇葡萄快速分类检索、3个对照品的薄层色谱鉴别方法，同时进行了指纹图谱相似度评价、相关性分析、主成分分析、聚类分析，确定1个影响品质的重要指标，筛选出3个推荐资源。在后续研究中，将进一步进行区域放大试验，考察资源产量、产品品质、抗病虫害能力等因素，最终筛选出适宜推广栽种的藤茶资源。

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Identification and Evaluation of Fingerprint for the WildResources

ZHANG Chao-yang1, MA Shi-long1,QIN Bang1, XIANG Ban-gui2, HU Bai-shun1*, CHEN Yong-bo1, LIU Yao1, CHEN E1

1.,445000,2.,,445000,

In order to establish the identification methods of plant morphology, microscopy, and thin layer chromatography (TLC) forresources, evaluate and screen the recommended resources, this study took thirteen wildresources collected and planted as the research object, identified them by comparing plant morphological characteristics, powder microscopic characteristics, TLC characteristic spots and fingerprint similarity. At the same time, ten common peaks of fingerprint comparison were used for correlation analysis, principal component analysis and cluster analysis. The results showed that the thirteen resources were all, but there were differences in plant morphology, TLC and fingerprint among different resources; The rapid classification and retrieval ofincluded the key points ofclassification; The difference in the microscopic characteristics of powder among resources was little; The spots at the corresponding positions of TLC of each resource were basically the same, but the color depth was different; Three principal components were extracted by principal component analysis, the cumulative contribution rate of variance was 91.583%, and the resource evaluation model was established at the same time:=0.577791+0.219762+0.118273; Cluster analysis clustered thirteen resources into 4 categories, with the highest score of group III and the lowest score of group IV. The wildresources of Jiangkou, Dingnan, and Sanjiang were selected as recommended resources.

wild; plant morphology; fingerprint

S567

A

1000-2324(2022)02-0188-09

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.02.003

2021-11-24

中组部西部之光访问学者计划;恩施州科技计划项目(XYJ2021000052);恩施州农科院青创项目(2020-009)

张朝阳(1989-),男,硕士,助理研究员,研究方向:藤茶生产、加工、品质评价. E-mail:316631555@qq.com

Author for correspondence. E-mail:279814350@qq.com