国槐花与刺槐花中黄酮的质量差异比较

付凤萍，高欣悦，余 佳，吴建英，余 琳，陈红英

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

国槐花与刺槐花分别来源于豆科植物国槐（Sophora japonicaL.）和刺槐（Robinia pseudoacaciaL.）开放的花，外观性状特征相似，均有药食两用价值。在资源开发中，国槐花主要用于中药入药，刺槐花主要用于食品饮品［1］。两者均含有丰富的黄酮类化合物，黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、抗炎、改善血液循环、降低胆固醇等多种功效作用。在应用中，二者通常统称为“槐花”，易发生混淆。国槐在中国历史悠久，原产于北方，其所开放的花为国槐花，也称槐花、槐蕊。一方面它可以直接食用，另一方面具有清热、凉血、止血、降压等功效而被收载于《中华人民共和国药典》（2020 版）（简称药典）［2］，与其他药材一同煎煮，对吐血、尿血、痔疮出血、风热目赤、高血压病、高脂血症、颈淋巴结核、血管硬化、大便带血、糖尿病、视网膜炎、银屑病等有显著治疗作用［3］。目前，国槐花有3 种炮制方法，分别是生槐花、炒槐花和槐花炭［2］。国槐花含有多种化学成分，如芦丁、槲皮素、鞣质、多糖类、维生素、挥发性成分等，其中黄酮类化合物芦丁含量大于6%［4，5］。刺槐为十九世纪从国外引进的树种，因生长快速、开花和制种能力强，能很好地适应各种环境条件，常作为绿化带植物。刺槐所开的花叫刺槐花，又名洋槐花，香味浓烈，有清热解毒、凉血止血、抗氧化等功效［6］，报道［7］认为该树种的甲醇提取物对乳腺癌MDA-MB-231细胞和健康MRC-5 细胞有抗癌作用，适合作为潜在的抗肿瘤治疗补充剂或营养食品补充剂。刺槐花的主要化学成分有刺槐苷、山奈酚、鞣质、芦丁、维生素、多糖等［8］。刺槐花也是广受欢迎的一种野菜，主要产品有槐花茶、槐花蜜和槐花糕等。

国槐花和刺槐花为同科近缘品种，外观相似，均含丰富的黄酮类生物活性成分。药典标准［2］中，除性状外，槐花（实为国槐花）质量主要考察总黄酮含量和芦丁含量。刺槐花目前尚无相应的质量标准可参考。为更好区分国槐花和刺槐花，规范相应的质量标准，试验以中国药典为标准，参照槐花（国槐花）的黄酮质量评价方法，分别用光谱法和色谱法对二者进行薄层色谱、总黄酮含量和芦丁含量比较分析，以期能对2 种槐花的有效使用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

不同产地国槐花1 和2 分别购自绵阳天城大药房、绵阳同仁堂药店。炒槐花和槐花炭由国槐花2按照药典［2］中槐花的炮制方法自制。野生刺槐花源于3 个不同产地的售卖品。所有样品均由西南科技大学卢学琴老师鉴定。芦丁对照品购自上海纯优生物科技有限公司，纯度≥98.0%。色谱级甲醇，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

KQ3200E 超声波清洗器（昆山市超声仪有限公司）；T6 新世纪紫外-可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SB-2 薄层色谱仪（天津市分析仪器厂）；Kromasil 100-5 C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）（浙江纳德科学仪器有限公司）；LC-210高效液相色谱仪（上海精科仪器有限公司）；硅胶GF254薄层板（青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 性状观察 干燥后的国槐花和刺槐花适量，从颜色、气味、外观、水泡等方面进行比较。

1.3.2 薄层色谱鉴别

1）对照溶液制备。精密称取芦丁适量，用甲醇溶解配制成2.0 mg/mL 的对照品溶液。

2）供试品溶液制备。分别称取供试品各0.5 g，加甲醇5.0 mL，超声提取5 min，补足甲醇，取滤液作为供试品溶液。

3）用移液枪取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，分别点于同张硅胶薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1，体积比）为展开剂，展开、晾干后，喷上1%三氯化铝乙醇溶液，待溶剂挥发后，在365 nm紫外光灯下观察。

1.3.3 总黄酮含量测定

1）对照品溶液制备。精密称取定芦丁对照品适量，用甲醇溶解配制成0.2 mg/mL 的对照品溶液。

2）供试品溶液制备。分别取各供试品粗粉约1 g，精密称定，置于索氏提取器中，用石油醚提取至提取器中溶液为无色，弃去石油醚溶液。再用甲醇提取至提取器中溶液无色，提取液用甲醇定容至100.0 mL 容量瓶中。精密量取 5.0 mL 置 50.0 mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀。

3）比色法测定总黄酮含量。精密量取对照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 与 6.0 mL，分别置于 25.0 mL 量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置 6 min，加氢氧化钠试液 10.0 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，在500 nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

4）供试品测定。精密量取供试品溶液3.0 mL，置于25.0 mL 量瓶中，各加水至6.0 mL，15%亚硝酸钠溶液1.0 mL，混匀，同比色法测定。

1.3.4 高效液相色谱法测定芦丁含量

1）系统适应性试验。C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相为甲醇-1%乙酸溶液（38∶62，体积比）；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长为257 nm；以0.1 mg/mL 对照品溶液为系统适用性溶液。理论板数按芦丁峰计算应不低于2 000。

2）溶液的制备。对照品溶液：精密称量芦丁对照品适量，用甲醇制成0.1 mg/mL 的溶液。供试品溶液：分别称取各供试品粗粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50.0 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率25 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2.0 mL，置10.0 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

3）样品测定。精密量取对照品溶液和供试品溶液，进样量为10 μL，应用外标法计算含量。

2 结果与分析

2.1 性状观察

国槐花与刺槐花外观具有明显差别（图1）。刺槐花干燥花呈白色带微绿色，完整者花萼钟状，花冠白色，旗瓣近圆形，体轻，气味芳香，味甘，沸水浸泡后，溶液为淡黄色。国槐花呈棕黄色，皱缩而卷曲，花瓣多散落，完整者花萼钟状，黄绿色，旗瓣阔心形，体轻，味较淡微苦，沸水浸泡后，溶液呈褐色。

图1 国槐花（左）和刺槐花（右）

2.2 薄层色谱分析

采用不同的硅胶薄层溶剂展开体系，如氯仿-甲醇-甲酸、乙酸乙酯-甲醇-甲酸、乙醇-水-冰乙酸等，以展开时间、芦丁的比移值（Rf）和斑点形状为指标进行选择，最后选用乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1，体积比）体系展开（图2）。由图2 可见，2 种槐花薄层色谱图差异明显，①与芦丁对照同一高度位置处，国槐花均显示有明显黄绿色荧光斑点，刺槐花在略高于芦丁位置处显示同样颜色荧光斑点；②同种槐花不同产地薄层色谱图无明显差异；③在溶剂线相同高度处，国槐有明显的荧光斑点，极性较小；而刺槐在低于芦丁位置近1/2 处，有明显的黄色荧光斑点，极性比芦丁大，此外，在溶剂线处有少许红色荧光斑点出现。

图2 国槐花和刺槐花365 nm 处的薄层荧光色谱

从图2 可以看出国槐与刺槐有明显的成分差异，国槐花中的主要黄酮成分为芦丁，但芦丁并不是刺槐花的主要黄酮成分，据文献报道［9，10］，刺槐花中主要黄酮成分为刺槐苷，是否为色谱图2 中的主斑点之一，有待进一步验证；不同产地同种槐花的薄层色谱图差异并不大。国槐2 炮制后随着温度升高，由炒槐花到槐花炭，芦丁的含量有所减少。

2.3 总黄酮含量测定

2.3.1 标准曲线 芦丁对照溶液曲线如图3，回归方程为y=10.946x-0.022 7，R2=0.996 8，表明芦丁对照溶液在浓度0.008～0.048 mg/mL 内线性关系良好。

图3 芦丁的标准曲线

2.3.2 总黄酮含量结果与分析 黄酮一般是有颜色的化合物，采用索氏提取法用乙醚脱掉色素干扰，再以甲醇为溶剂，对所有供试品进行总黄酮提取和比色法测定，结果见表1。结果显示，2 种槐花中总黄酮含量均较高，以芦丁计均大于8%［2］。国槐花总黄酮含量高于刺槐花中总黄酮含量；国槐花炮制后总黄酮含量随着炮制温度的升高（按照生槐花、炒槐花、槐花炭的顺序）逐渐降低。

表1 国槐花与刺槐花的总黄酮含量测定结果

国槐花中总黄酮的含量测定参考文献［2］，以芦丁为对照，但刺槐花总黄酮测定目前尚无统一的标准方法。刺槐花中目前已知的黄酮类化合物有刺槐苷、芦丁、槲皮素、山萘酚-3-O-β-D-半乳糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山柰酚等［11］。刺槐花试验结果与文献［12］结论相比偏高，参照文献［13］以刺槐苷为对照品，三氯化铝溶液显色紫外测定的方法得到刺槐花中总黄酮含量在3%左右，同采用药典方法进行测定的文献［13］报道结果基本一致。

国槐花不同炮制品有不同药效，随着炮制温度升高，黄酮类部分发生转化，药效由清热凉血向止血方向转化［14，15］。本试验结果与此一致，随着炮制温度升高，总黄酮含量依次降低。历史上还记载有地黄汁炒、麸炒、新瓦上炒香熟、焙、蒸、酒浸微炒、米醋煮等多种方法［16，17］，这些具体方法是否与特定化学成分有关，有待进一步调查研究。

2.4 芦丁含量测定结果

国槐花主要黄酮类物质为芦丁，药典［2］要求其含量≥6%，但刺槐花没有相应的质量指标。鄢长余［11］在刺槐花中分离得到山萘酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷、D-甘露醇、麦芽酚-3-O-［6′-O-（4″-羟基-反式-桂皮酰基）］-β-D-吡喃葡萄糖苷、D-3-O-甲基肌醇、山萘酚-3-O-β-D-半乳糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、刺槐苷等化合物，并认为其中4 个化合物（山萘酚-3-O-β-D-半乳糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、刺槐苷、芦丁、山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷）为黄酮主要成分。为方便比较，试验统一以芦丁为对照品，并模拟药典一测多评法［2］，测定刺槐花中其他主峰的含量。

在系统适用性试验中，因保留时间过长，调整流动相（甲醇∶1%乙酸，V∶V）的比例由32∶68 为38∶62，具体液相色谱见图4。可以看出，在试验条件下，国槐花与刺槐花色谱图差异较大，芦丁为国槐花的主要色谱峰，而刺槐花中明显有3 个峰，最后1 个峰经样品加标试验验证为芦丁的色谱峰。具体保留时间与含量计算结果见表2。

表2 国槐花和刺槐花高效液相色谱测定结果

图4 对照品和供试品液相色谱

以上结果说明，同种槐花不同产地的芦丁有含量上的差异，但色谱图差异不大。炮制后，随着温度升高，国槐花中主要成分芦丁的含量差异较大，这与上述总黄酮含量测定结果一致。药典要求，国槐花中芦丁含量应大于60 mg/g，试验中的国槐花均满足要求，但刺槐花的含量远低于这个标准，这也说明芦丁不是刺槐花中的主要黄酮类成分。参照文献［11］以甲醇-磷酸梯度洗脱，测得刺槐花中芦丁含量为0.4%，刺槐苷1.7%，山萘酚-3-O-β-D-半乳糖-7-O-α-L-鼠李糖苷和山萘酚-3-O-β-D-半乳糖苷分别为0.4%和0.3%。

3 小结与讨论

国槐花与刺槐花均含有丰富的黄酮成分，但从色谱图明显可见二者主要黄酮成分差异很大。芦丁为国槐花的主要黄酮成分，而不是刺槐花的主要黄酮成分。图2 所示薄层板在被喷上1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基溶液后，只有芦丁对应高度位置处显示有黄色斑点，而刺槐花无黄色斑点出现，说明其主成分清除DPPH 自由基的活性较弱。据文献报道［9，11］，刺槐花的主要黄酮成分为刺槐苷，此化合物极性和空间位阻比芦丁大，酚羟基比芦丁少，结构上似乎满足上述色谱图条件。此试验的刺槐花色谱图中主成分是否是刺槐苷，有待试验进一步考证。对于国槐花中总黄酮含量的测定，相关文献［13］与药典［2］均采用碱性条件三氯化铝比色法，但刺槐花目前还无相应的质量评价标准。为方便在同等条件下与国槐花比较，刺槐花也采用此法。总黄酮测定的结果表示为刺槐花每克样品中相当于芦丁的含量；在高效液相色谱测定中，以芦丁为参照，用类似于一测多评法［2］进行刺槐花中相应色谱峰的半定量的分析发现，刺槐花与国槐花都有稳定的薄层色谱图与高效液相色谱图，差异明显，不同产地的同品种槐花色谱图极为相似，仅有量上的不同。由此可见，用药典中槐花的质量评价方法，可以有效区分国槐花和刺槐花。

国槐与刺槐为近缘品种植物，国槐主要用于中药入药，刺槐主要用于食品饮品。两者均富含黄酮类生物活性物质，通常在经销和临床上，两者多有混用。用药典国槐花方法标准，两者薄层色谱和液相色谱图有明显差异，国槐花总黄酮含量和芦丁含量均高于刺槐花，但同种槐花不同产地的色谱图差异不大，仅呈现量的差异。槐花炮制后，总黄酮和芦丁含量有明显改变。试验结果对2 种槐花的有效区分和利用提供参考。