火麻仁粕蛋白水解液对发酵乳品质及抗氧化活性的影响

肖潇，王鹏，邵童，马昕怡，顾瑞霞，陈霞

(江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室(扬州大学)，江苏 扬州，225000)

发酵乳是牛乳经乳酸菌发酵制成的具有独特风味、均衡营养以及多重生理功能的乳制品[1]。近年来，随着人们对健康、营养型功能食品需求的不断增加，功能性发酵乳开发已成为食品行业的研究热点。目前，国内外许多学者开展了添加蛋白质和多肽的功能发酵乳研究，如添加蛋清蛋白[2]、乳清蛋白水解物[3]和大豆分离蛋白酶解物[4]等可以提高发酵乳的贮藏稳定性和益生菌活性；同时也有人研究将核桃粕多肽[5]、胶原蛋白肽[6]、小麦面筋蛋白肽[7]等用于功能性发酵乳的开发，结果发现不仅可以提高发酵乳的小分子肽含量，还可以提高发酵乳的抗氧化活性等功能。

火麻是一种重要的食品、医药和纤维植物，在我国广西、云南等地种植广泛[8]。火麻仁是火麻的成熟种仁，富含油脂、蛋白质和矿物质，是优质的植物油脂和蛋白资源[9]。火麻仁粕是火麻仁提取完油脂后的副产物，约含33%的蛋白质，不含蛋白酶抑制剂，且必需氨基酸和精氨酸含量较高，属高价值植物蛋白资源。但目前大多数火麻仁粕都被用于饲料或肥料，造成极大的资源浪费[10]。本试验从火麻仁粕中提取蛋白质，并利用碱性蛋白酶酶解不同时间后，得到不同水解度的火麻仁粕蛋白水解液(hemp seed meal protein hydrolysate, HP)。然后将HP添加到发酵乳中，研究不同酶解度的HP对发酵乳品质及抗氧化活性的影响，以期为开发新的功能发酵乳和提高资源利用率提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

乳粉，扬大康源乳业有限公司；脱脂火麻仁粕，辽宁俏牌生物科技有限公司；白砂糖，扬州麦德龙超市采购；嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌，江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室分离保藏；碱性蛋白酶，浙江一诺生物科技有限公司；水杨酸、铁氰化钾，国药集团化学试剂有限公司；硫酸亚铁，天津科密欧试剂有限公司；DPPH，麦克林；三氯乙酸，上海山浦化工有限公司；NaOH、HCl、浓H2SO4及其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

1510型酶标仪，美国Thermo公司；JF-SX-500全自动灭菌锅，日本TOMY公司；5804R高速冷冻离心机，德国EPPEENDORF公司；SPX-150BS生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；pH S-25 型数显pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；TMS-PRO质构仪，美国FTC公司；全自动凯氏定氮仪，北京盈盛恒泰科技有限责任公司；FREEZONE18L冷冻干燥机，美国LABCONCO公司。

1.3 试验方法

1.3.1 火麻仁粕蛋白的提取

参考林金莺[11]的方法提取火麻仁粕中的蛋白质，并将其冷冻干燥。

1.3.2 火麻仁粕蛋白水解

火麻仁粕蛋白与去离子水以质量比1∶25配制蛋白溶液，每克蛋白质加入2 000 U碱性蛋白酶，酶解温度45 ℃，酶解pH 8.5，分别水解4、8、12、16、20 h，沸水灭酶10 min，冷却，将溶液调至中性，离心收集上清液，得HP，分别记为H-4、H-8、H-12、H-16、H-20。

1.3.3 火麻仁粕蛋白水解度测定

参考陈霞等[12]的方法测定火麻仁粕蛋白水解度。

1.3.4 发酵乳样品制备工艺流程

发酵乳样品制备工艺流程如下：

12%全脂复原乳+7%白砂糖+6%HP→混合→均质(55 ℃，20 MPa)→灭菌(95 ℃，10 min)→冷却(42 ℃左右)→接种(3%)→发酵(42 ℃)→后熟(4 ℃，24 h)→成品

1.3.5 凝乳时间确定

参考胡凯丽等[13]的方法，待发酵乳滴定酸度至75 °T时记为发酵完成，记录时间。

1.3.6 质构特性测定

参考陈霞等[12]的方法，采用质地剖面分析(texture profile analysis,TPA)法，使用TMS-PRO 质构仪进行发酵乳质构的测定。测试条件：力量感应元的量程25 N；起始力0.01 N，检测速度1 cm/min，形变百分量60%。

1.3.7 pH值和滴定酸度测定

发酵乳的pH值参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》使用精密pH计进行测定；发酵乳的滴定酸度参考GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》进行测定。

1.3.8 持水率测定

参考陈霞等[12]的方法，称取7.00 g的发酵乳置于10 mL离心管中，6 000 r/min，30 min条件下离心，称量上清液质量。发酵乳的持水率计算如公式(1)所示：

(1)

1.3.9 活菌数测定

参考GB 4789.35—2016中的平板计数法测定发酵乳中的活菌数。

1.3.10 感官评价

感官评价标准参照GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》进行设定，参评人员为接受过感官评定培训的食品科学专业的10位学生(5男5女)，按照表1对发酵乳进行感官评分。

表1 感官评定标准Table 1 Criterion of sensory evaluation

1.3.11 抗氧化能力测定

1.3.11.1 样品前处理

于10 mL离心管中加入3 g发酵乳样品和4 mL甲醇，超声1 h，8 000 r/min条件下离心15 min，收集上清液。

1.3.11.2 DPPH自由基清除能力测定

参考LEE等[14]的方法，于517 nm处测定吸光度。

1.3.11.3 羟自由基清除能力测定

参考SHEN等[15]的方法，于510 nm处测定吸光度。

1.3.11.4 总还原能力测定

参考WANG 等[16]的方法，于700 nm测定吸光度。吸光值越高，还原能力越强。

1.4 数据分析

实验数据均采用SPSS 17.0和Origin 8.0软件进行统计分析和作图。

2 结果与分析

2.1 火麻仁粕蛋白酶解液的水解度分析

火麻仁粕蛋白经碱性蛋白酶酶解不同时间的水解度如表2所示。火麻仁粕蛋白酶解液的蛋白质含量、氨态氮含量和水解度均随着酶解时间的延长而不断升高，且在前12 h内水解度显著升高(P< 0.05)，12 h后水解度上升缓慢。说明在前12 h内绝大多数的火麻仁粕蛋白被酶解成短肽链，之后由于底物浓度和酶浓度的降低，且受酶解产物的抑制，酶解速率降低。为研究不同水解度HP对发酵乳品质的影响，选取低(H-4)、中(H-8)、高(H-12)3 个不同水解度的HP添加到发酵乳中，研究发酵乳品质及抗氧化活性的变化。

表2 火麻仁粕蛋白酶解液的水解度变化Table 2 Changes in the hydrolyzing degree of hemp seed meal protein hydrolysate

2.2 不同水解度HP对发酵乳品质的影响

由表3可知，添加HP能显著降低发酵乳的凝乳时间和胶黏性，提高发酵乳的内聚性、弹性和感官评分。空白组的凝乳时间为8.04 h，H-4、H-8和H-12组的凝乳时间分别比空白组缩短了1.44、1.80和1.99 h，说明水解度高的HP促发酵效果较好。原料奶里非蛋白氮含量较低，添加HP增加了发酵乳中小分子肽类和游离氨基酸的含量和种类，增加了乳酸菌可利用的氮源物质，可以促进乳酸菌生长代谢，使凝乳时间显著缩短。发酵乳的质构特性与酪蛋白的凝胶特性有直接的关系，HP含有的小分子肽可以增大发酵乳的黏度，同时可以促进乳酸菌生长产生胞外多糖，从而使发酵乳的内聚性和弹性增大[17]。赵强忠等[18]研究发现大豆分离蛋白经胰酶酶解24 h得到的酶解液对酸乳有较强的促发酵作用和增黏作用。添加了HP的3组发酵乳样品兼具发酵乳的香味和HP的香气，口感细腻，质地均匀，感官评分均显著高于空白组(P<0.05)，其中H-8组感官评分最高，为88.0分，产品的发酵乳香气和肽液的香气协调，口感最佳。

表3 发酵乳的发酵性能表Table 3 Fermentation performance table of fermented milk

2.3 HP水解度对发酵乳贮藏特性的影响

2.3.1 发酵乳贮藏过程中滴定酸度的变化

由图1可知，随着贮藏时间延长，4组发酵乳的滴定酸度均不断升高，其中空白组升高的幅度最大，到第21天时达到92.0 °T，比第0天高了17.0 °T；而添加量HP的3组样品的滴定酸度增幅均明显低于对照组，其中H-8组在冷藏至21 d时的滴定酸度最低，为87.5 °T。这是因为在低温贮藏过程中，乳酸菌仍会利用发酵乳中的乳糖发酵产酸，造成发酵乳酸度的持续上升，酸度过高则会影响产品的可接受度。HP中的蛋白质具有一定的酸中和能力，对于延长发酵乳的保质期和储藏期间的稳定性有一定的效果。赵强忠等[4]研究发现，大豆分离蛋白酶解产物中的小分子组分可通过降低酸奶中的杆/球菌比值从而减缓酸奶的后酸化过程。

图1 发酵乳在贮藏期间的滴定酸度变化Fig.1 Changes of titration acidity fermented milk during storage

2.3.2 发酵乳贮藏过程中持水率的变化

持水率的高低可以反映发酵乳凝胶网络体系的稳定性。由图2可知，H-8组的持水率随贮藏时间延长一直保持上升趋势，到第21天时的持水率为33.87%；其余各组的持水率呈先上升后下降趋势；其中H-4和H-8组的持水率在贮藏期内一直保持较高状态，到第21天时的持水率均大于30.00%，而空白组和H-12组到此时已经降到25.00%以下，说明在贮藏后期发酵乳的凝胶网络结构不稳定。这是因为发酵乳在贮藏初期的凝胶结构紧实，随着贮藏时间的延长，酸度不断降低，会影响酪蛋白凝胶网络的稳定性，其中空白组和H-12组样品的酸度较低，使得发酵乳的持水率下降[19]。

图2 贮藏期内发酵乳持水率的变化Fig.2 Changes in the water holding rate of fermented milk during storage

2.3.3 发酵乳贮藏过程中活菌数的变化

在4 ℃贮藏21 d发酵乳的活菌数变化见图3。添加了HP的3组发酵乳的活菌数在21 d内均显著高于空白组，H-4和H-8组在21 d内活菌数呈上升趋势，而空白组在第7天后开始下降，第21天时的活菌数下降为8.92 lgCFU/g；H-12组的活菌数呈先上升后下降的趋势，在第14天时活菌数达最高值，为9.31 lgCFU/g。上述实验结果说明添加HP可以促进乳酸菌的增殖，HP中的小分子肽和非极性游离氨基酸是乳酸菌理想的氮源，具有促进乳酸菌的生长代谢的作用，而牛乳中的蛋白质因分子质量较大，需经过保加利亚乳杆菌水解成酪蛋白才能被嗜热链球菌利用，因而空白组在后期活菌数下降迅速。胡月等[20]将大豆肽加入凝固型酸奶，发现大豆肽可以显著提高其贮藏期内的活菌数和氨基酸含量，可能是因为大豆肽本身含有谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸等氨基酸有利于保持乳酸菌生长。

图3 贮藏期发酵乳活菌数的变化Fig.3 Changes in the number of viable cells of fermented milk during storage

2.4 不同水解度的HP对发酵乳体外抗氧化活性的影响

由表4可知，添加了HP的3组样品的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力和总还原能力均显著高于空白组(P<0.05)，其中H-8组和H-12组的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力显著高于H-4组，而H-4组的还原能力最高，为0.61%。上述结果说明，添加HP可显著提供发酵乳的抗氧化能力，这是因为蛋白质被蛋白酶水解后分子构象发生变化，一些具有抗氧化能力的氨基酸残基被暴露出来，如色氨酸、酪氨酸、组氨酸和苯丙氨酸等，是样品组抗氧化能力提高的原因[21]。戴梓茹等[22]研究发现添加牡蛎肽可以显著提高酸奶的总还原能力和DPPH自由基清除能力。伍亚龙等[23]利用胰蛋白酶将原料乳适度水解后再接入发酵剂发酵，制得的发酵乳抗氧化活性也显著提高。

表4 发酵乳的体外抗氧化活性Table 4 In vitro antioxidant activity of fermented milk

3 结论

从火麻仁粕中提取蛋白质，经碱性蛋白酶酶解不同时间后，得到水解度分别为8.45%、13.24%和16.62%的HP。将HP添加到发酵乳中，发现不同水解度的HP均显著缩短了发酵乳的凝乳时间，降低了发酵乳的胶黏性，提高了发酵乳的内聚性、弹性和感官评分；对发酵乳贮藏特性的研究表明，添加HP能缓解发酵乳的后酸化，提高发酵乳的持水率和活菌数。发酵乳的抗氧化活性研究表明，添加HP显著提高了发酵乳的抗氧化活性，但H-8组和H-12组的抗氧化活性无显著差别。H-8组在贮藏末期酸度上升幅度较小，第21天时持水率最高，感官评分最高，活菌数含量和抗氧化活性也较高，为品质最佳的一组样品发酵乳。