郁金配伍丁香对小鼠肝纤维化影响的实验研究

汪居安，宋雪敏，王俐晴，王亚奇，谢露红，汪 炜，王健君

(皖南医学院 1.临床医学院；2.组织学与胚胎学教研室,安徽 芜湖 241002)

“丁香莫与郁金见”是“十九畏”之一，最早来源于《医经小学》[1]，是中药配伍禁忌的主要内容之一。《中华人民共和国药典(2015年版)》也记载“丁香不宜与郁金同用”[2]。然而丁香同方配伍郁金自古有之，如《春脚集》所载“十香返魂丹”用于治疗痰厥中风昏迷[3]，现代网络重叠社团[4]发现，两药配伍还可应用于呃逆、胸痹(冠心病)等病的治疗。长期以来，“十九畏”同方配伍的禁忌争议不断，且缺乏足够的理论支持与科学验证结果[5]。

肝纤维化是肝脏细胞外基质过度异常增生的病理过程，是多种慢性肝病向肝硬化进展的关键步骤，是所有慢性肝病的共同病理基础[6-7]。中药郁金抗肝损伤、抗纤维化的确切作用已得到验证[8-10],本研究以丁香配伍郁金，探究丁香的存在对郁金缓解小鼠肝纤维化的影响，以期进一步探索丁香郁金配伍的理论内涵，丰富和发展中药配伍禁忌内容。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级5周龄左右的健康雄性KM小鼠32只，体质量(25±2)g,由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，实验动物生产许可证:SCXK(辽)2020-0001；实验动物使用许可证:SYXK(皖)2018-004,分笼饲养,室温25。C左右，自由进食和进水。

1.2 主要药品、试剂及器械 丁香粉、郁金粉(六安市丹贝尔生物科技有限公司)；CCl4(成都市科龙化工试剂厂，批号20130329)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)测试盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测试盒、透明质酸(HA)测试盒、白细胞介素-6(IL-6)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒(均购自南京建成生物工程研究所)。多功能酶标仪(美国BioTek公司)；数码显微镜(北京京昊永成贸易有限公司)；离心机(上海安亭科学仪器厂。

1.3 药品配置 精确称取郁金粉2 g，适量温水溶解，文火煮沸2 h，蒸发浓缩至50 mL(相当于生药浓度400 mg/mL)；药品总质量不变，丁香与郁金粉按1∶1配置，重复如上操作。冷却至室温后，放入冰箱备用。CCl4与橄榄油按1∶9比例混合，配成10%的CCl4溶液，常温避光保存。

1.4 动物分组与给药方法 动物适应性饲养1周，随机均分为4组。郁金组、丁郁组按2 mL/kg灌胃给药，空白组、模型组给予等量的生理盐水；灌胃同时，郁金组、丁郁组、模型组按2 mL/kg腹腔注射10%CCl4的橄榄油溶液，空白组腹腔注射等量橄榄油。每周3次，持续7周。

1.5 生化检测 于末次给药24 h后摘取眼球取血，7 500 r/min离心2 min，取血清用相应测试盒检测小鼠ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA含量。

1.6 动物标本的制备 取血后脊椎脱臼处死小鼠，迅速剖腹取肝，取肝右叶浸泡于福尔马林溶液固定24 h后，脱水、石蜡包埋、苏木精伊红(HE)染色制成组织切片，通过数码显微镜检查各组小鼠肝脏的组织结构并摄像。

2 结果

2.1 各组小鼠ALT、AST活性比较 模型组、郁金组、丁郁组的血清ALT、AST水平均高于空白组(P<0.05)；郁金组、丁郁组的血清ALT、AST水平均低于模型组(P<0.05)；丁郁组血清AST水平低于郁金组(P<0.05)。其他详见表1。

2.2 各组小鼠HA、IL-6、SOD、MDA水平比较 模型组的血清HA、IL-6、MDA水平均高于空白组(P<0.05)；郁金组、丁郁组的血清HA、IL-6、MDA水平均低于模型组而高于空白组(P<0.05)；郁金组、丁郁组的血清SOD水平均高于空白组和模型组(P<0.05)；丁郁组的血清HA、IL-6水平低于郁金组(P<0.05)。其他详见表1。

表1 中药对小鼠血清HA、IL-6、SOD、MDA水平的影响

2.3 肝组织病理切片观察 空白组肝细胞结构正常，无明显变性坏死与炎细胞浸润；模型组肝细胞结构模糊，可见大量气球样变、坏死、明显炎细胞浸润与胶原纤维沉积；郁金组和丁郁组与模型组相比，细胞变性坏死、炎细胞浸润与胶原纤维沉积的数量和范围均有较大改善；郁金组和丁郁组两者细胞变性坏死程度与范围相近，但后者炎细胞浸润与胶原沉积程度较轻。见图1。

标尺500 μm。A.模型组；B.空白组；C.郁金组；D.丁郁组。

3 讨论

CCl4是一种强溶脂性的有机溶剂，进入肝脏后经肝细胞色素P450依赖性功能氧化酶的代谢，生成自由基CCl3-和CCl3O23-破坏肝细胞膜结构,使膜磷脂过氧化而生成脂质过氧化物(lipid hydroperoxide,LPO),导使肝细胞损坏[13]。ALT和AST是胞内酶，当肝细胞损坏时会释放入血，引起血清含量升高。SOD是体内主要的抗氧化酶，其通过催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，从而防止细胞膜脂质过氧化,保护细胞膜的完整性，其活力的高低反映了机体清除自由基的能力；MDA是LPO的中间代谢产物之一，其水平可反映脂质过氧化的程度，间接地反映细胞受自由基攻击的程度[14]。

CCl4作用于肝星状细胞使其激活和转化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞迅速增殖发展为肝纤维化[15]。HA为胶原成分之一,可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量，其水平与肝纤维化的严重程度呈正相关。肝细胞变性坏死释放多种炎症因子,IL-6是最主要炎症因子之一,可作用于肝脏成纤维细胞产生胶原进一步加重肝细胞损伤与纤维化[16]。

本研究结果显示，模型组的血清HA、IL-6、MDA水平均高于空白组(P<0.05)，镜检显示肝细胞结构模糊，可见大量气球样变、坏死、明显炎细胞浸润与胶原纤维沉积，说明本研究用CCl4成功造模肝纤维化小鼠，验证了CCl4通过自由基损伤与炎症反应两方面导致肝纤维化的形成。模型组血清SOD水平与空白组差异无统计学意义(P>0.05)，可能是由于细胞被大量破坏导致SOD生成减少以及SOD抗氧化时的大量消耗。

本研究结果也显示，郁金组和丁郁组肝细胞结构较模型组清晰，细胞变性坏死、炎细胞浸润与胶原纤维沉积的数量和范围均有较大改善，且两组血清HA水平均高于空白组(P<0.05)但低于模型组(P<0.05)，说明两组小鼠均发生纤维化但程度较模型组轻；郁金组和丁郁组血清ALT、AST、IL-6、MDA水平均低于模型组(P<0.05)，SOD水平高于模型组(P<0.05)，说明郁金单用或合用丁香均能减轻CCl4对肝细胞的损伤与纤维化，减轻炎症反应，增强抗氧化能力。就两组中药而言，丁郁组血清AST轻度降低(P<0.05)，ALT、SOD、MDA水平与郁金组差异无统计学意义(P>0.05)，说明丁香、郁金两药合用对郁金抗肝损伤、抗氧化的作用无明显影响或可能有增强作用，两药在该方面不属“相畏”范畴；丁郁组血清HA、IL-6水平与郁金组相比降低(P<0.05)，说明两药配伍能够增强郁金抗炎与抗纤维化的能力，提示两药在该方面属“相使”范畴。值得注意的是，因两药合用能够显著减轻炎症反应，减轻胶原的沉积，我们推测，从长期来看，两药合用可能能够进一步延缓肝细胞变性坏死，从而表现出较郁金单用更强的抗肝损伤与氧化的作用。限于本研究时间较短，该推测需进一步研究验证。

综上所述，CCl4通过产生自由基和炎症反应两方面造成肝纤维化；郁金单用或合用丁香均能够通过增强抗氧化能力和减轻炎症反应干预肝纤维化；郁金合用丁香不影响郁金抗损伤、抗氧化能力，且能够提高郁金抗炎、抗纤维化作用；两药配伍就治疗肝纤维化而言不属“相畏”或似属“相使”范畴。

“十九畏”作为古代医家智慧的结晶，至今仍指导着中药临床应用。然而，“师古而不泥古”，当今中医药工作者应当充分开展实验与临床研究，取其精华，弃其糟粕，不断补充和发展中药配伍禁忌内容，形成更科学、严谨的中药配伍理论，用以指导临床应用。