广西厚皮甜瓜根腐病病原菌鉴定及抗病种质筛选

叶云峰，解华云，杜婵娟，李天艳，赵廷昌，杨 迪，覃斯华，黄金艳，洪日新，何 毅，付 岗

（1.广西壮族自治区农业科学院园艺研究所 南宁 530007； 2.广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所南宁 530007； 3.中国农业科学院植物保护研究所 北京 100093）

厚皮甜瓜（L.ssp.）是广西地区重要的园艺作物和经济作物，栽培面积约0.67 万hm，南宁市和北海市为主要种植区，柳州市、来宾市、桂林市等地区也有少量种植。在广西，厚皮甜瓜必须在保护地内种植才能获得成功。温暖湿润的亚热带气候使得甜瓜在该地区每年可以种植2 茬，但高温多雨的气候特点，加之2 茬种植缺乏轮作机制，致使该地区甜瓜病害发生程度远高于北方地区，土传病害尤甚。近年来，甜瓜根腐病发生严重，并感染所有当地主栽品种，造成大量植株在瓜采收前10～15 d 开始整株萎蔫枯死，病株果实不能正常膨大和成熟，品质和产量显著下降。发病率普遍达20%以上，严重的大棚发病率在80%～100%，减产20%～40%，严重制约了广西甜瓜产业的健康发展。

我国其他地区也有甜瓜根腐病发生的报道。20 世纪80 年代末，该病害首先在新疆喀什地区巴楚、伽师、岳普湖等县开始发生，90 年代初迅速传遍喀什地区各县市，重病田发病率达100%，造成毁灭性损失。20 世纪90 年代至21 世纪初，山东费县甜瓜根腐病造成20%以上的减产。甜瓜根腐病蔓延快、危害大、造成的损失重，于21 世纪初发展成为我国西北和东部地区的重要病害之一。

目前，国内已报道能引起甜瓜根腐病的病原菌有多种，分别是腐皮镰孢菌（）、黑点根腐病菌（）、黑腐病菌（）和尖孢镰孢菌（）等。国外报道的甜瓜根腐病菌主要有黑点根腐病菌（.）、腐皮镰孢菌（.）、瓜果腐霉（）、立枯丝核菌（）和层出镰刀菌（.）等。而引起广西地区厚皮甜瓜根腐病的病原菌分类地位尚未明确。

甜瓜根腐病属于土传病害，防治困难。目前，尚无高效防治方法，而筛选抗病种质资源、选育和应用抗病品种，是最安全、有效的防治措施。国内外目前关于甜瓜根腐病抗源筛选研究的报道极少。仅见国内的杨颖等从薄皮甜瓜种质资源中鉴定筛选到高抗材料16 份，为挖掘抗病基因资源改良厚皮甜瓜根腐病抗性打下了基础。国外未见有相关研究报道。

为了明确广西地区厚皮甜瓜根腐病病原菌的分类地位和筛选抗病种质材料，笔者对采集于厚皮甜瓜主产区南宁市和北海市的病样进行病原菌分离纯化，通过致病性测定试验确定病原菌株，结合形态学和分子生物学特征对病原菌进行分类鉴定。同时，通过苗期抗病性鉴定方法从厚皮甜瓜种质资源中筛选抗病材料，旨在为甜瓜根腐病的防治和抗病育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供致病性测定的厚皮甜瓜品种为北甜1 号，是当地主栽品种之一，易感根腐病。供抗病性鉴定的27 份厚皮甜瓜材料是由广西壮族自治区农业科学院园艺研究所通过多年自交纯化和筛选获得的纯系材料，编号分别为：M5、M23、M57、M63、M66、M73、M75、M77、M78、M79、M81、M84、M85、M87、M88、M90、M93、M95、M97、M100、M102、M106、M108、M112、M123、M125 和M128。

1.2 病害症状观察及病样采集

2021 年3—6 月在厚皮甜瓜整个生长期观察甜瓜根腐病的发生发展情况，并进行记录和拍摄。在广西南宁市武鸣区和北海市银海区等厚皮甜瓜主产区采集病样，两地种植品种均为北甜1 号，种植时间为3 月上旬，株距0.6 m，行距1.0 m，武鸣区采样地连片种植面积6.7 hm²，采集病样6 份，样品编号为T1～T6，银海区采样地连片种植面积10 hm²，采集病样6 份，样品编号为T7～T12。取样时注意区分根腐病和枯萎病病株，根腐病病株茎基部维管束不变褐或者变褐但不向茎蔓扩展，环境湿度大时，茎基部有白色霉状物，茎蔓裂口处无琥珀色胶状物溢出，病部无缢缩；枯萎病病株维管束变褐，逐步向茎蔓扩展，环境湿度大时，茎基部有白色或粉红色霉状物，茎蔓裂口处有琥珀色胶状物溢出，病部稍缢缩。

1.3 病原菌的分离纯化

采用组织分离法进行病原菌分离。从病株根部的病健交界处切取5 mm×3 mm×1 mm 的组织块，75%乙醇消毒20 s，0.1%升汞消毒1 min，无菌水清洗4 次，置于PDA 平板培养基上，每皿放3 个组织块，每份样品分离3 皿，28 ℃下培养4 d，选择出现率高且形态一致的菌落，采用单孢分离法进行菌株纯化。

1.4 病原菌的致病性测定

从纯化获得的菌株中选5 株代表性菌株接种于PDA 培养基上，28 ℃培养12 d，用无菌水将培养基上的分生孢子洗下，制成浓度为1×10个·mL的孢子悬浮液备用。甜瓜种子于32 ℃下催芽48 h后种于70 孔的育苗盘上，于育苗棚内生长7 d 后，甜瓜幼苗的子叶展平，将其从营养杯中轻柔拔出，将根部置于孢子悬浮液中浸泡15 min 后再植入育苗盘中，以清水浸根的植株为对照，每个菌株接种20 株幼苗，3 次重复。用薄膜覆盖保湿48 h，温度保持在25～35 ℃。定期观察植株发病情况，确定发病症状与根腐病症状是否一致，如果一致，从发病组织上进行病原菌分离，并确定分离所得菌株与接种菌株形态特征是否一致，如果一致可确定为病原菌。

1.5 病原菌的分类鉴定

1.5.1 病原菌的形态学鉴定 将具有致病性的菌株接种至PDA 培养基上，28 ℃培养7 d，观察记录菌落生长情况和形态特征，在光学显微镜下观察产孢结构及分生孢子的形态，并测量50 个分生孢子的大小。

1.5.2 病原菌的分子生物学鉴定 采用真菌DNA提取试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司）对5个病原菌株的总DNA 进行提取。使用通用引物ITS1（5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）对病原菌的核糖体转录间隔区序列（ITS）进行基因扩增。PCR 反应体系和反应程序参考叶云峰等的方法。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认有目标条带后，委托北京擎科生物科技公司进行测序。测序结果在NCBI 数据库中进行BLAST 同源性比对，并采用MEGA-X 软件的Neighbor Joining法构建基于rDNA-ITS 基因的系统发育树，以确定病原菌的分类地位。

1.6 甜瓜种质材料的抗病性鉴定

试验于2021 年8—10 月在南宁市西乡塘区可利村的大棚育苗基地开展。病原菌的培养及孢子悬浮液的制备、接种和甜瓜材料的种植参考1.4 的方法，每份材料接种10 株幼苗，3 次重复，定期观察和记录发病情况。接种病原菌40 d 时，对种质材料进行抗性水平鉴定，抗性划分标准参考杨颖等的标准，略作修改（表1）。

表1 甜瓜根腐病抗性分级标准

2 结果与分析

2.1 病害症状

该病害主要发生在大棚甜瓜生长中后期，坐果后15～20 d 开始有少量植株出现叶片黄化并萎蔫的症状，萎蔫植株早晚可恢复正常，反复3～5 d 后，整株萎蔫枯死不再恢复。在坐果后30～35 d（收瓜前10 d 左右），发病达到高峰期，出现大量萎蔫枯死植株（图1-A）。病株果实较正常植株的果实小，不能正常膨大和成熟。植株根部皮层褐色干腐，容易断根，须根少（图1-B、C）。环境湿度大时，茎基部产生少量白色霉状物。剖开茎基部，有部分病株可看到茎基部维管束变褐色，但不向茎蔓扩展（区别于枯萎病）。如碰到连续阴雨天后天气忽然变晴的情况，病害发生严重。

图1 厚皮甜瓜根腐病田间症状

2.2 病原菌的分离纯化

分离的病样组织块被培养4 d 后，共长出103个真菌菌落，其中有89 个白色菌落形态一致，占总数的86.4%，所有病样的分离物中都有这种菌落，每份病样选择其中1 个菌落进行单孢分离纯化，共获得12 个纯化的菌株，编号为TG1～TG12，与病样编号T1～T12 相对应。

2.3 病原菌的致病性测定

接种病原菌后20～25 d，所有处理的植株都开始出现病症，子叶陆续开始黄化或枯死；接种后30～35 d ，基部真叶开始黄化或枯死，根部出现褐色病斑或腐烂（图2-A）；55～65 d ，整株叶片黄化或枯死（图2-B）。对照植株无症状（图2-C）。对病株根部进行病原再分离，得到的菌株形态特征与接种菌株一致，表明接种的菌株是甜瓜根腐病的病原菌。

图2 厚皮甜瓜接种病原菌后的发病症状

2.4 病原菌的分类鉴定

2.4.1 病原菌的形态学鉴定 在PDA 培养基上，菌落圆形、平铺，气生菌丝白色、绒毛状（图3-A），培养基背面乳白至黄褐色，有蓝色色素（图3-B）。菌丝无色、分枝、平滑，具隔膜。小型分生孢子肾形或卵圆形，（5.1～15.5）μm×（2.9～4.6）μm。大型分生孢子纺锤形、直或稍弯曲，两端钝圆，顶孢稍弯，多为1～3 个 隔 膜，（22.9～33.5）μm×（4.4～6.4）μm（图3-C）。产孢细胞为长筒形单瓶梗（图3-D），长在气生菌丝上。

图3 病原菌形态特征

2.4.2 病原菌的分子生物学鉴定 经PCR 扩增和电泳检测，5 个菌株TG1、TG3、TG5、TG7 和TG8 均获得长度约为530 bp 的电泳条带。扩增产物经测序，均获得了对应的rDNA-ITS 基因序列。5 段基因序列（GenBank 登录号：OL308582～OL308586）分别在NCBI 数据库中进行了BLAST 同源性比对。结果表明，与这些序列同源性最高的均为腐皮镰孢菌（.）的菌株，同源性均达99%以上。采用MEGA-X 软件构建了系统发育树（图4），结果表明，5 个菌株的rDNA-ITS 基因序列均与.聚于同一最小分支。结合形态学和分子生物学鉴定结果，将广西厚皮甜瓜根腐病的病原菌鉴定为腐皮镰孢菌（.）。

图4 基于rDNA-ITS 序列的病原菌菌株与其他相关菌株的系统发育树

2.5 甜瓜种质材料的抗病性鉴定

抗病性鉴定结果表明，不同甜瓜材料的抗性水平不同，在27 份甜瓜材料中表现高抗的材料有3份，分别为M87、M102 和M125，占供试材料的11.11%；表现抗的材料有6 份，分别为M23、M78、M84、M100、M112 和M123，占供试材料的22.22%；表现感的材料有7 份，占供试材料的25.93%；表现高感的材料有11 份，占供试材料的40.74%（表2）。

表2 不同厚皮甜瓜种质材料对甜瓜根腐病的抗性水平

3 讨论与结论

根腐病近年来在广西大棚厚皮甜瓜主产区发生日益严重，并上升为重要病害之一。本试验对该病的病原菌进行分离和致病性测定，并结合形态学和分子生物学特征将其鉴定为腐皮镰孢菌（.）。鉴定结果与北京、新疆、山东费县等地区的甜瓜根腐病菌鉴定结果一致。此外，甘肃省中部半干旱种植区的甜瓜根腐病菌被鉴定为黑点根腐病菌（.）。甘肃皋兰地区的甜瓜根腐病菌被鉴定为尖孢镰孢菌甜瓜专化型（.f. sp.）及黑点根腐病菌（.）。黑龙江省齐齐哈尔地区的甜瓜根腐病菌被鉴定为黑腐病菌（.）。可见，在我国能引起甜瓜根腐病的病原菌多样化，因此，及时、准确鉴定出病原菌的分类地位，有利于病害的针对性防控和降低经济损失。

据报道，由腐皮镰孢菌引起的甜瓜根腐病在不同生育期的发病症状和类型不同，主要有猝倒型（苗期发生）、根腐型（各生育期均可发生）、萎蔫型（伸蔓期、开花坐果期发生）和果腐型（中后期发生）。经调查，广西地区的厚皮甜瓜根腐病症状主要是萎蔫型，其症状与甜瓜枯萎病症状极其相似，需仔细区分并采取对应的防治措施。

国内外关于甜瓜根腐病抗源筛选研究的报道极少。仅见国内的杨颖等开展了相关研究，认为厚皮甜瓜根腐病抗源贫乏，于是从薄皮甜瓜种质资源中鉴定筛选到高抗材料16 份，表明薄皮甜瓜种质资源中蕴含着对改良厚皮甜瓜根腐病抗性有潜在利用价值的基因资源。本试验对27 份厚皮甜瓜材料进行了苗期抗病性鉴定，筛选到抗性水平为高抗和抗的材料分别为3 份和6 份，表明厚皮甜瓜种质材料中也蕴含抗病基因资源，下一步有望从更多的厚皮甜瓜种质材料中挖掘高抗资源。此外，在厚皮甜瓜材料的苗期抗病性鉴定试验中，发现厚皮甜瓜在接种病原菌后发病进程比杨颖等描述的薄皮甜瓜的发病进程更加缓慢。本试验在参考薄皮甜瓜根腐病抗性分级标准的基础上，结合厚皮甜瓜接种病原菌后的实际发病情况，制定了适用于厚皮甜瓜的根腐病抗性分级标准，为后续开展厚皮甜瓜材料抗病性评价提供借鉴。

本试验首次明确了广西地区厚皮甜瓜根腐病病原菌为腐皮镰孢菌（.），并筛选到抗性水平为高抗和抗的材料共9 份，为甜瓜根腐病的防治和抗病育种奠定了基础。