赤水麻竹叶多糖提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

戴天伦,李洪庆，陶文亮，许子竞，杨玉琼

(1.贵州民族大学 化学工程学院 贵州特色生物资源工程技术中心，贵阳 550025；2.贵州省科学技术协会，贵阳 550025；3.贵州工程应用技术学院 化学工程学院 天然产物中心，贵州 毕节 551700)

麻竹(DendrocalamuslatiflorusMunro)为多年生禾本科牡竹属木本植物，广泛分布于我国贵州、广西、云南等南方地区[1]。目前，赤水市对麻竹资源的开发体系已初具规模，一般用作造纸原料、编织制品等，又因麻竹生长迅速，其笋亦可作为食品加工原料[2]。然而，随着麻竹资源的开发利用，附带产生大量的竹叶剩余物，其利用率低，经常被当作废弃物丢掉，不仅浪费资源，而且污染环境[3]。诸多研究都表明竹叶多糖具有良好的降血脂、抗氧化、抗疲劳、降血糖等生理功效[4-7]，是一种天然的食品添加剂，已有部分学者将竹叶多糖作为调味剂制成各种营养保健饮品[8-9]。因此，对麻竹叶多糖提取工艺及体外抗氧化活性的研究具有较高的理论意义和实际意义。

目前，国内外对于麻竹叶多糖的超声波辅助提取工艺及抗氧化活性研究鲜有报道。本研究通过超声波辅助提取麻竹叶多糖，在单因素试验基础上利用响应面优化提取工艺，并对粗多糖清除DPPH·、·OH的能力进行了研究，为进一步开发麻竹叶资源提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

麻竹叶：购于贵州赤天化纸业股份有限公司，由贵州民族大学生态环境工程学院苏春花副教授鉴定为麻竹叶；葡萄糖(AR)：购于武汉远成共创科技有限公司；DPPH(2,2-联苯基-1-苦基肼基)、硫酸亚铁、水杨酸、Vc(抗坏血酸)、过氧化氢：购于上海浩洋生物科技有限公司；苯酚、无水乙醇、硫酸：均为国产分析纯。

KQ-500DE 超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；UV-1900i紫外分光光度计、ATY224电子天平 日本Shimadzu公司；旋转蒸发仪 常州金南仪器制造有限公司；TD5Z台式低速离心机 盐城凯特实验仪器有限公司；冷冻干燥机 杭州川一实验仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 麻竹叶多糖提取及检测

1.2.1.1 麻竹叶多糖提取工艺

取一定量粉碎的麻竹叶，经95%乙醇脱脂后，烘干备用。准确称取25 g脱脂麻竹叶，置于超声波清洗机中，加入适量的纯水，超声波辅助提取，提取3次。合并提取液，浓缩至100 mL，加入浓乙醇调至含醇80%左右，4 ℃醇沉过夜，离心，得粗多糖沉淀物。沉淀用少量纯水溶解，离心过滤，上清液浓缩，醇沉，冷冻干燥，得麻竹叶粗多糖(DLP)。

1.2.1.2 麻竹叶多糖含量的检测

参照文献[10]的方法。以葡萄糖浓度(C)为X轴坐标，吸光度(A)为Y轴坐标，得标准曲线方程：A=10.167C+0.0012，R2=0.9998，线性范围：0～0.08 mg/mL。

将1.2.1.1所得各粗多糖配制成浓度为1.0 mg/mL的溶液，按上述方法检测。将测得的吸光度A带入上述回归方程可求得多糖含量，计算提取率。提取率计算公式如下：

1.2.1.3 单因素试验

按1.2.1的方法，分别考察料液比、提取温度、提取时间和超声功率各单因素对麻竹叶多糖提取率的影响。

1.2.1.4 Box-Benhnken中心组合试验设计

在1.2.1.3试验基础上进行响应面设计优化，以麻竹叶多糖提取率为响应值Y，以料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、超声功率(D)为变量因子，因子编码及水平见表1。

表1 响应面设计试验因子编码和水平Table 1 The factors and levels of response surface design test

1.2.2 抗氧化活性试验

称取干燥麻竹叶粗多糖，配制成一系列不同浓度溶液，检测抗氧化活性。

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的测定

依照文献[11]的方法，在7支试管中先加入2.0 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)，再分别加入4.0 mL不同浓度(0.25，0.5，0.75，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL)的麻竹叶多糖溶液，避光反应30 min后在517 nm处测其吸光度；去离子水代替样品溶液作为空白组；无水乙醇代替DPPH溶液作为对照组；阳性对照为VC。重复测定3次，按下式计算清除率：

式中：A0为对照组；A1为样品组；A2为空白样品组。

1.2.2.2 ·OH清除率的测定

取7支试管，分别加入1.0 mL不同浓度(0.25，0.5，0.75，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL)的麻竹叶多糖溶液，再依次加入1.0 mL FeSO4溶液(9 mmol/L)、1.0 mL水杨酸(9 mmol/L)，最后加入1.0 mL H2O2(8.8 mmol/L)显色。静置40 min后，检测吸光度A510 nm[12]；去离子水替换样品溶液作为空白组；去离子水替换 H2O2溶液作为对照组；对照组为Vc。重复测定3次，按下式计算清除率：

式中：A0为对照组；A1为样品组；A2为空白样品组。

1.3 数据处理

试验数据以Origin 2018处理，Design-Expert 8.0.6进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对麻竹叶多糖提取率的影响

固定提取条件为超声功率300 W、提取温度70 ℃、提取时间40 min，由图1可知，随着料液比从1∶10 (g/mL)增大至1∶25 (g/mL)，多糖提取率从1.24%上升到最高值2.08%。之后继续增大料液比，多糖提取率趋于平衡。料液比过高会消耗大量溶剂，也会增加后续浓缩工作的时间。综合考虑，料液比选取1∶25 (g/mL)最为适宜。

图1 料液比对多糖提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.1.2 提取温度对麻竹叶多糖提取率的影响

由图2可知，当固定超声功率300 W、提取时间40 min和料液比1∶25 (g/mL)时，随着提取温度的不断增加，提取率也呈上升趋势，在70 ℃时达到最大值2.12%。当温度继续升至80 ℃时，提取率下降，可能是过高的温度对多糖结构产生破坏，从而降低提取率。因此，提取温度选择70 ℃为宜。

图2 提取温度对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.1.3 提取时间对麻竹叶多糖提取率的影响

由图3可知，当固定超声功率300 W、提取温度70 ℃和料液比1∶25 (g/mL)时，麻竹叶多糖提取率随着提取时间的延长而增大。当提取时间为40 min时，多糖提取率达到最大值1.2%。随着提取时间的延续，提取率趋于平缓。因此，提取时间选择40 min为宜。

图3 提取时间对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extration rate of polysaccharides

2.1.4 超声功率对麻竹叶多糖提取率的影响

由图4可知，当固定料液比1∶25 (g/mL)、提取时间40 min和提取温度70 ℃时，麻竹叶多糖提取率随着超声功率的增加而增大，在300 W时达到最大值1.45%。而后继续增加超声功率，多糖提取率略有下降。因此，选取300 W为最佳超声功率。

图4 超声功率对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

2.2 响应面试验结果及数据分析

2.2.1 Box-Benhnken试验方案设计及结果

表2 Box-Benhnken试验设计与结果Table 2 The design and results of Box-Benhnken test

续 表

通过响应面软件Design-Expert 8.0.6进行方差分析，结果见表3。

表3 回归系数的显著性分析Table 3 The significance analysis of regression coefficients

回归方程：Y=2.32+0.063A-5.000E-003B+0.034C+8.333E-004D+0.092AB-0.043AC+0.035AD-0.013BC+0.02BD+0.063CD-0.16A2-0.25B2-0.086C2-3.083E-003D2。

该回归模型F=10.63，方程极显著(P<0.01)，失拟项F=0.4992>0.05，失拟项不显著，说明该回归方程可信，能预测试验的真实性。此模型的相关系数R2为0.9140，表明该模型的可信度为90%以上，因此，可以利用此模型来预测麻竹叶的多糖含量。单因素A极显著(P<0.01)；依据F值大小(FA=10.93>FC=3.18>FB=0.068>FD=1.89E-03)，因此影响因素的大小顺序为A>C>B>D。A、B、C、D因素两两交互作用响应面见图5～图10。

图5 料液比与提取温度的交互影响Fig.5 Interaction between solid-liquid ratio and extraction temperature

由图5可知，粗多糖提取率随着料液比的提高而增大，在提取时间40 min、提取温度70 ℃和料液比1∶25 (g/mL)时，等高线上出现极值点，即多糖提取率达到最大值；由图6可知，在功率300 W和温度70 ℃恒定时，多糖提取率随着提取时间的延长而上升，等高线上出现极值点；由图7可知，超声功率与料液比的交互作用影响较小，在等高线上无极值点，这与单因素试验结果一致；由图8可知，提取时间与提取温度交互作用时，响应面图出现一个最高点，等高线上出现极值，表明在其他条件不变时，随着这两个因素的变化，多糖提取率可达到一个最大值；由图9可知，当保持提取温度不变时，随着超声功率变大，多糖提取率变化不大，这与单因素试验结果一致，表明超声功率对多糖提取率结果的影响最小，这也符合响应面方差分析的结果；由图10可知，超声功率与提取时间的交互作用影响较小；由以上分析可以看出，在其他两因素不变时，料液比对多糖提取率的影响最大，时间次之，超声功率对多糖提取率的影响最小，这与方差分析结果一致，表明该模型可靠，可用于指导麻竹叶多糖的提取。

图6 料液比与提取时间的交互影响Fig.6 Interaction between solid-liquid ratio and extraction time

图7 料液比与超声功率的交互影响Fig.7 Interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic power

图8 提取温度与提取时间的交互影响Fig.8 Interaction between extraction temperature and extraction time

图9 提取温度与超声功率的交互影响Fig.9 Interaction between extraction temperature and ultrasonic power

图10 提取时间与超声功率的交互影响Fig.10 Interaction between extraction time and ultrasonic power

2.2.2 响应面优化试验及验证

对响应面回归方程求一次偏导，联立方程解得理论最佳提取参数为：料液比1∶25.05 (g/mL)、提取温度69.07 ℃、提取时间39.2 min、超声功率289.7 W。根据试验实际情况，调整提取参数为：料液比1∶25 (g/mL)、提取温度69 ℃、提取时间39 min、超声功率300 W，3次平行试验得出麻竹叶多糖平均提取率为2.26%，将理论参数带入响应面模型得到预测值为2.22%，相对误差为1.77%，表明该模型可靠。

2.3 麻竹叶多糖体外抗氧化活性试验结果

2.3.1 麻竹叶多糖对DPPH自由基的清除能力

由图11可知，麻竹叶多糖对DPPH自由基的清除能力较强，多糖浓度从0.25 mg/mL升至3.0 mg/mL时，其清除率随着浓度增加而升高，当浓度增到3.0 mg/mL时，清除率达到77.8%，当多糖浓度达到4.0 mg/mL时，多糖对DPPH自由基的清除能力可达Vc的96.8%，表明麻竹叶多糖对DPPH自由基具有较强的清除作用。

图11 粗多糖对DPPH自由基的清除率Fig.11 The DPPH radical scavenging rate of crude polysaccharides

2.3.2 麻竹叶多糖对·OH的清除能力

由图12可知，随着多糖浓度的升高，其对·OH的清除率从8.25%提高到47.1%，但当麻竹叶多糖浓度达到2.0 mg/mL后，继续升高多糖浓度，对·OH的清除率增加缓慢；多糖浓度为4.0 mg/mL时，麻竹叶多糖对·OH的清除率最高，可达Vc的58.2%，由此表明麻竹叶多糖对·OH有一定清除能力。

图12 粗多糖对羟自由基的清除率Fig.12 The hydroxyl radical scavenging rate of crude polysaccharides

3 结论

在考察不同料液比、提取温度、提取时间和超声功率单因素试验的基础上，通过响应面软件的设计来优化超声辅助提取麻竹叶多糖的工艺，得到最佳实际工艺参数为：料液比为1∶25 (g/mL)、提取温度69 ℃、提取时间39 min、超声功率300 W，经3次验证试验，多糖平均实际提取率为2.26%，其响应面模型得到理论值为2.22%，相对误差为1.77%，表明该模型真实性高，可用于麻竹叶多糖的提取。体外抗氧化活性试验表明，麻竹叶多糖具有良好的抗氧化活性。其中，多糖对DPPH自由基的清除能力强于玉竹多糖[13]；在浓度为4.0 mg/mL时，对·OH的清除能力可达到同等浓度下Vc的58.2%。说明麻竹叶多糖在食品工业中具有很大的潜力，不仅能使食品具有竹叶清香，更能增强食品的抗氧化能力。