一种暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense引起的枣炭疽病

解小锋，杨绪强，亓玉昆，孟晓晔，韩凤英，刘文璋，刘 慇，韩传明，王清海

（1.山东省林业保护和发展服务中心，山东 济南250014； 2.山东省济南市长清区文昌林业站，山东 济南250300； 3.山东省林业科学研究院，山东 济南250014； 4.山东农业工程学院，山东 济南250100）

枣（Zizyphus jujuba Mill.），鼠李科、枣属，果肉甘甜味美，汁多果脆，富含丰富的维生素和矿物质元素，被誉为“天然维生素丸”。枣为中国特有树种，在我国具有悠久的栽培历史。枣树适应性广、抗逆性强，在我国新疆及黄河中下游流域均有分布。 近年来，随着栽培模式的升级、品种的更新换代，我国枣栽培面积及产量稳步增长，2019年我国枣产量达746.4 万t。

由炭疽菌属（Colletotrichum sp.）真菌引起的炭疽病是枣产区的一种重要植物病害，造成严重的经济损失[1]。仅2007年，枣炭疽病在山西省柳林、晋中地区造成了14 亿元的损失[2]。 炭疽菌属真菌全球性分布，危害寄主范围广，尤其危害鳄梨、芒果等高档水果，造成的经济损失严重。 国内已有的报道表明枣炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）[1,3-8]，在枣炭疽病菌鉴定方面，大多数文献依靠形态学特征，少量文献通过形态学特征和ITS 序列分析相结合的方法。目前研究表明，胶孢炭疽菌是一个复合种[9]，是否有其他炭疽菌可以引起枣炭疽病，尚不清楚。

2019年8月，作者在山东省济南市仲宫镇小门牙村枣园调查时，发现枣叶（品种：仲秋红）上出现圆形或不规则形褐色病斑，病叶率达30%以上，感病枣树树势较弱。 因此完全有必要明确其病原种类，为该病的有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

感病枣叶片，2019年8月，从山东省济南市仲宫镇小门牙村枣园采集。

1.2 方法

1.2.1 枣炭疽病菌株分离纯化

样品分离采用常规的组织分离方法。 采集的枣炭疽病病叶70%乙醇表面处理后，在叶片病健交界处，用无菌的解剖刀切成小组织块（5 mm×5 mm）。 然后依次1%次氯酸钠（1 min），70%乙醇溶液（1 min），无菌水冲洗3 次。将处理后的小组织块置于PDA 平板上（5 块/皿），28℃，散光条件下培养。5d 后，挑取单个菌落菌丝，置于新的PDA 平板上，散光条件下28℃培养7 d，在接种点附近产生橘红色分生孢子团，用移菌环刮取少量孢子置于无菌水中，配成孢子液，在PDA 平板上涂布、培养。2d 后挑取单个菌落，获得纯化菌株。获得纯化菌株均在山东省林业科学研究院森林保护研究所保存。

1.2.2 致病性测定

获得单孢菌株致病性通过离体接种的方法进行测定。 选取成熟、新鲜、健康的枣叶（品种：‘仲秋红’），自来水冲洗30 秒，自然晾干，75%的酒精消毒处理，备用。 随机选取JNZG11、JNZG311、JNZG313 菌株在PDA平板上培养7d，制成孢子悬浮液（×106孢子/mL），备用。 用无菌针（φ = 0.5 mm）轻微刺伤叶片，在伤口处接种200 μL 孢子悬浮液，以无菌水为对照。 将处理后的枣叶置于含有少量无菌水的无菌烧杯中，用保鲜膜封闭，28℃，培养7 d，观察叶片的发病情况，并与田间症状进行比较。

1.2.3 病原鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定

选取JNZG11、JNZG311、JNZG313 菌株作为代表性菌株， 置于PDA 平板培养（28 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗）培养5 d，观察记录菌株的培养特征。5d 后挑取菌落产生的子实体（黑色小粒点），制作玻片，通过尼康50i显微镜（Nikon Eclipse 50i，日本）、QImaging 照相系统（QImaging 加拿大）、cellSens 软件，观察分生孢子及附着胞形态并测量其大小。

1.2.3.2 分子鉴定

采用改进的CTAB 法提取供试菌株的DNA[10]。 选取以下6 种保守基因进行扩增与测序，分别为：核糖体转录间隔区序列（ITS）、几丁质合成酶A 基因（CHS-1）、肌动蛋白基因（ACT）、β-微管蛋白基因（TUB2）、3 -磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）和钙调蛋白基因（CAL）为目的基因。 以ITS1/ITS4、CHSⅠ-79F/CHSⅠ-354R、ACT-512F/ ACT-783R、βt2a/βt2b、GDF-1/ GDR1、CL1/ CL2 分别为ITS、CHS-1、ACT、TUB2、GAPDH和CAL 基因的引物进行扩增测序。 扩增反应体系25 μL（Taq 酶mix 12.5 μL，上游引物下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA 模板2 μL）。 PCR 参数：预变性（95°C，5 min）、变性（94°C，30 s）、退火（ITS:58°C，30 s；CHS-1、GAPDH: 56°C，30 s；ACT、TUB2、CAL: 59°C，30 s；）。 PCR 产物送往上海派森诺生物科技有限公司进行双向测序。

将各个菌株 （JNZG11*、JNZG12*、JNZG14*、JNZG15*、JNZG311*、JNZG313*） 的ITS、ACT、CHS-1、GAPDH、CAL 和TUB2 基因序列提交到GenBank数据库中 （基因编号：ITS: MT570098、MT570094、MT570096、MT570095、MT570093、MT570097；ACT: MT894282、MT894284、MT894293、MT894288、MT894289、MT894292；CHS -1: MT894270、MT894271、MT894272、MT894273、MT894274、MT894275；TUB2: MT894280、MT894276、MT894278、MT894277、MT894281、MT894279；GAPDH：MT894283、MT894287、MT894285、MT894286、MT894290、MT894291；CAL:MT894268、MT894264、MT894266、MT894265、MT894269、MT894267）。选取Colletotrichum gloeosporioides 复合种内的43 株菌株作为参考菌株[11]，以C.boninense 模式菌株MAFF 305972 为外围菌株。 通过MEGA 7.0 软件中的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建多基因（ACT-CHS-1-GAPDHITS-CAL-TUB2）系统发育树，以自展法（Bootstrap）进行检测（循环1000 次）。

2 结果与分析

2.1 枣炭疽病症状

2019年8月， 作者在山东省济南市仲宫镇小门牙村枣园调查时发现枣树叶片受害严重， 病叶率达到30%以上。 危害枣树叶片， 在叶片形成圆形或近圆形斑点，病斑中央褐色，凹陷，轮纹状排列小黑点，四周黑褐色，病斑外围有淡黄色晕圈。 叶脉对病斑扩展限制作用随着病斑扩大， 几个病斑扩展成不规则形坏死斑，部分坏死斑脱落，中央形成穿孔（图1），严重影响叶片光合作用，后期造成叶片早落。

图1 枣炭疽病田间症状Figure 1 Disease symptom on leaves of jujube in field

2.2 离菌株致病性

枣叶片接种孢子液5 d 后， 在叶片接种部位均表现出症状，发病率为100%（图2a），而接种无菌水的叶片未表现出症状（图2b）。叶片病斑圆形或近圆形， 中央稍微凹陷，黑褐色。 病斑扩大成近圆形或不规则形的坏死斑，坏死斑有黑色小粒点（子实体）产生，少量橘红色粘质（分生孢子）（图2a）。接种后产生的症状与田间观察的症状一致。 通过同样的分离方法，从接种产生的坏死斑上可以分离到与接种菌株形态特征一致的菌株。 由此可见，本试验分离获得的菌株可以引起枣炭疽病，是其病原菌。

图2 致病性试验(a)果实接种后病斑；(b) 对照Figure 2 Pathogenicity test (a) necrotic lesions on leaves inoculated with isolate JNZG313; (b) control with sterile water

2.3 枣炭疽病菌形态学鉴定

在PDA 培养基上，菌丝初期白色，菌丝致密，菌落平整，边缘整齐。 后期逐渐形成淡黄色，背面色素黑褐色（图3a）。分生孢子单胞无色，内含油滴、纺锤形至椭圆形（图3b），大小为(11.1-) 12.7-13.3 (-17.8) ×(-4.4)5.2-5.5 (-6.3) μm (13.0 ±1.2 × 5.3 ± 0.5 μm, n = 50)，长宽比为2.5。 附着胞卵圆形、不规则形，深褐色（图3c），大小为(7.3-) 8.6-9.2 (-9.8) ×(-5.1) 5.8-6.9 (-7.0) μm (= 8.9±0.7×6.3±0.7 μm, n=50)，长宽比为1.4。 通过观察发现JNZG311 JNZG313 产孢较多，JNZG11 产孢较少。 其分生孢子附着孢大小、菌落形态与胶孢炭疽菌复合种(Colletotrichum gloeosporioides complex)形态学特征一致。

图3 Colletotrichum siamense 形态特征（a）菌落形态；（b）分生孢子；（c）附着胞Figure 3 Colletotrichum siamense (a) cultural character； (b) conidia； (c) appressoria

2.4 枣炭疽病病菌多基因序列分析

将获得的6 株菌株的6 个基因序列串联后， 与暹罗炭疽菌模式菌株ICMP 18578 相似度为99.6%。 在采用最大似然法构建的多基因（ACT、CHS-1、GAPDH、ITS、CAL、TUB2）系 统发育树（图4）中，以粗体表示的为模式菌株， 在分支节点处标注自展率， 标尺指示为0.02 步变化。 系统发育树最高对数似然值为-8965.61。 本试验获得的6 株菌株（JNZG11*、JNZG12*、JNZG14*、JNZG15*、JNZG311*、JNZG313*）聚在暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）进化分支上（自展率94%）。

图4 利用最大似然法基于枣炭疽病菌ACT、CHS-1、GAPDH、ITS、CAL和TUB2 的基因数据构建的系统发育树。 （自展率标于节点处，所用模式菌株由粗体表示，以Colletotrichum boninense MAFF305972 为外围菌株，标尺指示0.02 步变化。 ）Figure 4 Phylogenetic tree of isolates of red-fleshed apple anthracnose with allied taxa calculated with sequence data of concatenated ACT,CHS-1, GAPDH, ITS, CAL, and TUB2 using maximum likelihood method (1,000 bootstrap replicates; bootstrap values indicated at nodes, the highest log likelihood =-8965.61).

结合分离菌株的形态特征、培养性状、多基因系统发育分析以及致病性测定，明确了暹罗炭疽菌可以引起枣炭疽病。

3 结论与讨论

炭疽菌属植物真菌1790年首次发现，1831年建立炭疽菌属，距今已有230 余年的历史，其分类一直比较混乱。依靠形态特征、寄主范围为主的分类系统，以及ITS 序列对复合种内的近源种不能有效区分。 直到2009年Cai et al 提出了利用多基因系统发育分析结合形态学并辅助其它鉴别手段的综合方法，逐渐被接受，成为目前比较权威规范的炭疽菌分类方法。 枣炭疽病是枣树生产中常见的一类重要的植物真菌病害， 国内已有的报道认为其病原为胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides），其分类依据主要依靠形态学特征或辅以ITS 序列分析。 本实验通过感病枣叶样本组织分离、 单孢纯化、致病性测定，表明分离获得单孢菌株均可以引起枣炭疽病。 通过对分离菌株ITS、CAL、TUB2、GAPDH、ACT、CHS-1 等多基因系统发育分析， 结合形态特征、 培养形状， 确定分离获得菌株为暹罗炭疽菌（C.siamense）。 本次研究结果首次明确了暹罗炭疽菌可以危害枣（Z.jujuba），引起炭疽病，这与已有的枣炭疽病原种类报道不同。

近年来，国内外学者在苹果、核桃、芒果、草莓、辣椒[12]等寄主上发现多种炭疽菌侵染危害。随着炭疽菌属真菌研究的深入，越来越多的研究证明确实存在多种炭疽菌侵染同一寄主的现象。 台湾青枣（Z.mauritiana）炭疽病病原已被证实存在果生炭疽菌 （C.fructicola） 和暹罗炭疽菌（C.siamense）等2 种病原菌[13]。 台湾青枣又称印度枣、毛叶枣，为鼠李科枣属植物，与Z.jujube 均为枣属，是否存在果生炭疽菌侵染危害Z.jujube，还有待进一步研究。 本次实验受采样地点和采样数量的限制，仅分离获得暹罗炭疽菌一个种，随着今后采样量的增加，是否会有其它炭疽菌或炭疽菌新种还有待进一步研究。

暹罗炭疽菌是Prihastuti et al （2009年）在泰国咖啡上首次发现，引起咖啡炭疽病[14]。 暹罗炭疽菌分布范围广，已在非洲、美洲、大洋洲、亚洲均有发现[15-18]。 随着对暹罗炭疽菌的关注，危害寄主的种类范围越来越广，本研究首次发现暹罗炭疽菌侵染枣引起炭疽病，枣是其新寄主。 因此，在枣炭疽病研究及制定防控方案时，暹罗炭疽菌同样是不可忽视的。 目前，有关暹罗炭疽菌引起的枣炭疽病的发生流行、种群结构以及有效的防治措施还有待进一步研究。