白果内酯对高脂饮食诱导小鼠非酒精性脂肪肝的影响*

姚 宁， 周 霖， 王肖辉， 杨红梅

(郑州大学第一附属医院a.肿瘤内科；b.药学部；c.超声科，郑州450052)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的特征是肝脏脂肪变性，无饮酒史。有研究[1]表明，肥胖可显著增加NAFLD的发病率。随着当今生活节奏的加快和饮食习惯的改变，肥胖等慢性病患者数量剧增，引起了全球公共卫生工作者对现今社会健康问题的关注[2]。此外，NAFLD和肥胖是许多代谢性疾病的重要诱因，如2型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和癌症。因此，寻找高效安全的预防和治疗方法已成为当前NAFLD的重要研究热点[3-4]。

核因子相关因子(Nrf)是一种与机体防御功能密切相关的转录蛋白，其机制与氧化应激密切相关[5]，属于亮氨酸拉链转录因子家族。Nrf在组织细胞的氧化应激防御过程中起重要的调节作用，主要参与组织细胞的氧化应激防御过程。Nrf上调可以保护组织和器官免受有害因素的影响，对肝脏有多种作用，主要是调节肝脏代谢、协助肝脏解毒及促进肝细胞再生。因此，在急慢性肝损伤、脂肪肝、肝纤维化、肝癌等方面均有保护作用[6-7]。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是真核细胞特有的一种具有良好保守性的核蛋白。有研究[8]表明，HMGB1与全身和局部炎症反应密切相关，与炎症的严重程度呈正相关。

白果内酯(bilobalide,BA)是银杏叶提取物中唯一的倍半萜类化合物。银杏叶提取物对中枢神经系统神经元具有良好保护作用。而作为银杏叶提取物的重要成分之一，BA对心绞痛、心肌梗死、冠心病、高血压、心律失常等心脑血管性疾病有良好疗效，尤其对脑部疾病和神经系统疾病。BA如何作用于NAFLD的报道较少，故本研究探讨BA对高脂饮食(high-fat diet，HFD)诱导小鼠NAFLD的作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 BA(纯度≥96%)(宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号:WTLS-010)。甘油三酯(TG)(批号：20180324)、总胆固醇(TC)(批号：20180412)、谷丙转氨酶(ALT)(批号：20180403)、谷草转氨酶(AST)(批号：20180403)、超氧化物歧化酶(SOD)(批号：20180415)、丙二醛(MDA)(批号：20180420)、过氧化物酶(CAT)(批号：20180420)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(批号：EK0526)、白细胞介素-1β(IL-1β)(批号：SP12225)、白细胞介素-6(IL-6)(批号：EK0412)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；BCA蛋白定量试剂盒(批号：P0009)购自上海碧云天生物技术有限公司。所有抗体均购自Cell Signaling Technology, Inc。

1.1.2 动物 ICR小鼠60只，雄性，2月龄，体质量20～22 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：SCXK(鲁)20190003，动物质量合格证号：370726210101048423，动物实验均按照郑州大学动物伦理学指南操作进行，伦理批准号：202102151663。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组 60只小鼠适应性饲养7 d，正常组15只，HFD组45只。正常组采用正常饮食，HFD组给予HFD。饲养4周后，将HFD组分作为模型组、BA(20 mg·kg-1)组和BA(40 mg·kg-1)组[9],各15只。接下来的4周，继续给予HFD，BA组小鼠分别给予BA(20、40 mg·kg-1)灌胃，正常组和模型组给予等体积的生理盐水。

1.2.2 肝功能指标的检测 血清中ALT和AST的水平根据试剂盒说明书采用全自动生化分析仪(日本日立，7600型)测定。

1.2.3 检测血清及肝脏血脂水平 将收集的血液静置45 min后，3 000g离心15 min获取血清。采用生理盐水(1 g：9 mL)制备肝组织匀浆，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，收集上清液后备用。根据试剂盒说明测定血清和肝脏中TC和TG水平。

1.2.4 血清和肝脏中氧化指标的检测 根据试剂盒说明书，测定血清和肝脏SOD、CAT和MDA指标水平。

1.2.5 血清和肝脏中细胞因子水平的检测 按照试剂盒说明书检测小鼠血清和肝脏细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平。

1.2.6 肝脏的组织病理学分析 制备小鼠肝脏病理切片，随机取3只小鼠肝脏的相同部分，立即用质量分数4%多聚甲醛溶液固定。标本包埋在石蜡中，切片用苏木精-伊红(HE)染色，最后用甘油固定。将制备的切片在100倍光学显微镜下拍照，并观察染色及评估肝脏病理变化。

1.2.7 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测肝脏Nrf-2/血红素加氧酶1(HO-1)/HMGB1/核因子κB(NF-κB)信号通路蛋白 提取肝组织细胞的总蛋白，并进行蛋白定量检测。变性、装载、电泳，转移到聚偏氟乙烯膜上，采用质量分数5%脱脂奶粉封闭，加入相应的抗体及质量分数1%脱脂奶粉。稀释为一级和二级抗体，然后通过增强型化学发光(ECL)高级试剂盒进行观察，并通过凝胶成像系统进行检测。

2 结果

2.1 BA对NAFLD小鼠肝功能酶的影响 与正常组比较，模型组血清AST和ALT水平较高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，BA(20 mg·kg-1)组和BA(40 mg·kg-1)组AST和ALT水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1，图1。

表1 各组小鼠ALT、AST检测指标比较

注：##)与正常组比较， P<0.01；**)与模型组比较，P<0.01。

2.2 BA对血脂水平的影响 与正常组比较，模型组血清和肝脏TC、TG水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，BA(20 mg·kg-1)组和BA(40 mg·kg-1)组血清和肝脏的TC、TG水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2，表2。

注：##)与正常组比较，P<0.01；**)与模型组比较，P<0.01。

表2 各组小鼠血清和肝脏TG、TC指标比较

2.3 BA对血清和肝脏氧化应激水平的影响 与正常组比较，模型组MDA水平升高，抗氧化酶(SOD与CAT)水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，BA(20 mg·kg-1)组和BA(40 mg·kg-1)组MDA水平降低，SOD与CAT水平增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3-4，图3。

表3 各组小鼠血清SOD、MDA、CAT指标比较

表4 各组小鼠肝脏组织SOD、MDA、CAT指标比较

注：与正常组比较，##)P<0.01；与模型组比较，**)P<0.01。

2.4 BA对血清和肝脏细胞因子的影响 与正常组比较，模型组IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，BA(20 mg·kg-1)组和BA(40 mg·kg-1)组IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5-6,图4。

表5 各组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α指标比较

表6 各组小鼠肝脏组织IL-6、IL-1β、TNF-α指标比较

注：##)与正常组比较，P<0.01；**)与模型组比较，P<0.01。

2.5 组织病理学变化 与正常组肝脏比较，模型组出现细胞质中脂滴的积聚和肝组织中炎症细胞的浸润，BA(20 mg·kg-1)组和BA(40 mg·kg-1)组逆转上述病理变化过程。见图5。

图5 组织病理学变化(×100)

2.6 BA对肝脏Nrf-2/HO-1/HMGB1/NF-κB通路的影响 与正常组比较，模型组肝脏中Nrf-2和HO-1水平降低，HMGB1、p-P65(phosphorylation nuclear factor kappa beta, p-P65)和p-IkBa(phosphorylation inhibitory subunit of nf kappa b alpha, p-IkBa )水平升高。与模型组比较，BA提高了小鼠肝脏中Nrf-2和HO-1的水平，降低了小鼠肝脏中HMGB1、p-P65和p-IkBa的水平。见图6。

图6 BA对肝脏Nrf-2/HO-1/HMGB1/NF-κB通路的影响

3 讨论

流行病学研究[10-11]表明，NAFLD是最常见的慢性肝病。随着物质生活水平的提高，我国肥胖患者的数量迅速增加，由肥胖引起的NAFLD的发病率呈快速上升趋势。血脂异常(包括TC和TG)是肥胖患者常见的代谢症状之一[12-13]。血脂水平可以反映全身脂质代谢，如今，HFD的流行增加了饮食中脂肪的摄入，增加了体内游离脂肪酸的含量，并增加了TG的积累。一旦超过肝脏储存极限，就会产生有毒的脂质代谢产物，这些代谢产物会导致肝损伤或肝功能障碍[14-15]。因此，本研究以血清和肝脏中的TC、TG为指标，观察NAFLD中脂肪蓄积和肝损伤的程度。本研究结果发现，模型组小鼠的TC、TG升高；BA组小鼠的TC、TG含量降低。表明NAFLD模型成功建立，且BA可以改善HFD引起的小鼠血脂异常状态。

在HFD诱导肥胖小鼠的过程中，随着肝脏不断积累TG和游离脂肪酸，从而产生了过量的活性氧。体内自由基代谢平衡主要通过抗氧化系统来维持，包括SOD和CAT等[16]。MDA是脂质过氧化降解的主要产物，不仅能阻止线粒体呼吸链的电子传递，还能促进炎症反应，从而抑制肝脏中抗氧化酶的活性(SOD、CAT)[17]。本研究结果显示，与模型组相比，BA明显降低MDA水平，增加SOD、CAT水平。

“攻击性”炎症细胞因子(如TNF-α和IL-6)的无序产生往往与代谢综合征的发病机制密切相关。NF-κB能够调节TNF-α和IL-6等因子，其是转录和合成的关键调节因子。因此，通过NF-κB信号通路调节机体免疫炎症反应可积极改善NAFLD[18]。本研究结果发现，与正常组相比，模型组IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高；与模型组相比，BA干预组IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低。

Nrf-2是一种重要的抗氧化蛋白，能抵抗多种因素引起的炎症和氧化应激，促进多种抗氧化基因的表达，Nrf-2激活需要Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(KEAP-1)的调节[19]。在外部氧化应激的刺激下，Nrf-2将从KEAP1中释放并降解，从而与抗氧化相关元素(ARE)结合，包括NAD(对位)氢醌氧化还原酶(NQO1)和HO-1，最终发挥抗炎和抗氧化机制[20]。HO-1是一种参与炎症和氧化应激的重要蛋白质，Nrf-2/HO-1激活NF-κB并调节细胞因子表达[21]。HMGB1为具有215个氨基酸的多肽链，由三个结构域组成，其首先被鉴定为一种存在于细胞核中高度保守的转录因子，以维持核小体结构并调节基因转录，后来被确认为一种细胞因子，在细胞损伤时释放或由单核细胞和巨噬细胞分泌。有研究[22-23]表明，HMGB1也参与脂质代谢，阿托伐他汀可以通过降低血浆HMGB1水平来降低IL-6和TNF-α水平。众所周知，在经典的NF-κB信号通路中，其亚基P65(活化形式为p-P65)与抑制性因子IkBa结合并被抑制，促炎因子等在激活kappa B抑制因子激酶(IKK)复合体后，后者使IkBa磷酸化(形成p-IkBa)，进一步诱导NF-κB被释放出来，活化的NF-κB进一步被磷酸化并转移入核，诱导相关靶基因的表达[24]。本研究结果显示，BA显著提高了小鼠肝脏中Nrf-2和HO-1的水平，并降低了小鼠肝脏中HMGB1、p-P65和p-IkBa的水平。总之，BA通过调节小鼠的脂质水平、氧化应激水平和炎症水平来改善NAFLD的肝脏病理变化，其机制可能与调节Nrf-2/HO-1/HMGB1/NF-κB通路有关。

随着人们生活水平的提高，饮食结构逐渐向高脂肪、高蛋白和高糖方向转变，从而诱发高水平的能量代谢，导致氧化应激水平急剧增加。脂质代谢异常伴有氧化应激的发生，而氧化应激及其产生的脂质过氧化物能够继续促使线粒体功能失调，肝细胞功能受损，进一步形成恶性循环[25]。同时，脂质代谢紊乱还可通过影响单核细胞、M1/M2漂移、核苷酸结合寡聚化结构域样(含pyrin结构域)受体蛋白3炎症小体等诱导炎症反应的发生。而炎症反应还会进一步促进细胞对脂质的摄取和蓄积，抑制细胞脂质流出，与脂代谢紊乱共同促进了脂肪肝的发展。NF-κB等信号通路还能够调节炎症与脂代谢之间的相互作用[26]。综上，BA主要通过调节脂质代谢中的氧化应激及炎症反应等关键环节，从而起到治疗NAFLD的作用。

此外，白果树叶能够促进人体肠胃蠕动，加快消化和吸收，从而起到预防便秘的作用；同时也可有效降低人体胆固醇含量，防止脂肪细胞在体内的堆积，不仅可以对预防高血压起到间接效果，而且对于减肥也具有积极的辅助效果。而BA是白果的主要活性成分，是否也可通过影响胃肠的消化吸收功能，从而对脂肪肝的形成和损伤起到一定的保护作用，这一科学假设有待进一步实验验证。