蔗糖异构酶PalI在解脂耶氏酵母中的高水平表达及酶学性质表征

宋 蕾， 李 宪 臻， 郭 小 宇

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

异麦芽酮糖(6-O-α-D-吡喃葡糖基-D-果糖)，为蔗糖的同分异构体，具有与蔗糖极其相似的理化性质。美国食品药品监督管理局(FDA)于2005年将异麦芽酮糖认证为公认安全(GRAS)的食品原料，可在食品生产中根据需要不限量地添加。其被人体食用后，人体内葡萄糖和胰岛素含量仍然维持在一定范围内，能够有效预防糖尿病，可看作理想的健康食品[1-2]。

目前研究报道关于制备异麦芽酮糖的方法包括酶催化法、微生物转化法、植物转化法及化学合成法。化学合成法带来高能耗、高污染问题，工业化制备异麦芽酮糖一般选用环境友好的酶催化法和微生物转化法[3-4]。酶催化法中常用到蔗糖异构酶，蔗糖异构酶又被称作异麦芽酮糖合成酶，是一种葡萄糖基转移酶。该酶以蔗糖为底物进行异构化反应生成异麦芽酮糖和海藻酮糖两种主要产物，同时水解蔗糖生成葡萄糖和果糖为副产物[5]。但目前利用蔗糖异构酶进行蔗糖转化过程中仍存在诸如酶解副产物较多、多数蔗糖异构酶的表达系统为非食品级、蔗糖异构酶的表达水平及酶活性不高、蔗糖异构酶的稳定性不高等问题，这些问题严重阻碍了异麦芽酮糖的工业化生产与利用的进程[6-8]。

解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是一种非常规酵母，半子囊菌纲(Hemiascomycetes)耶氏酵母菌属，为非致病菌[9]。近年来，Y.lipolytica作为异源蛋白表达宿主的研究飞速进展，来自不同生物体的蛋白质已在该酵母中成功表达[10-11]。因其独特的生理特性和酶系统，该酵母在食品工业中广泛应用。解脂耶氏酵母被FDA认定为可以广泛应用于食品工业中的微生物[12-13]。

本实验将Klebsiellasp. LX3中蔗糖异构酶编码基因PalI进行密码子优化，构建于解脂耶氏酵母外泌表达菌株中进行表达纯化，获得重组蔗糖异构酶PalI，并进行酶学性质表征及酶解产物的分析，以期为提高蔗糖异构酶的酶解产物异麦芽酮糖的工业化生产与应用提供理论依据[14]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

EscherichiacoliDH5α，大连宝生物有限公司；YLEX Expression Kit试剂盒，益生生技有限公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase、10×Loading Buffer、dNTP Mixture、rTaq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、250 bp DNA Marker、1 kb DNA Marker、蛋白Marker(Low)、限制性内切酶XbaⅠ、SfiⅠ、NotⅠ，大连宝生物有限公司。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L；LB固体培养基：琼脂粉15.0 g/L，其余同LB液体培养基。YPD液体培养基(pH 4.0)：蛋白胨20.0 g/L，酵母提取物10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L；YPD固体培养基：琼脂粉15.0 g/L，其余同YPD液体培养基。YNB固体培养基：葡萄糖20.0 g/L，不含氨基酸的酵母氮碱6.7 g/L，硫酸铵5 g/L，琼脂15 g/L。

梯度PCR仪，Eppendorf；DYY-11型电泳仪，北京市六一仪器厂；TGL-16高速台式冷冻离心机，湘仪离心机厂；ImageQuantLAS4000凝胶成像分析系统，GE医疗；AKTA蛋白质纯化系统，GE医疗；离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；高效液相色谱，安捷伦科技有限公司；APS-2氨基柱，赛默飞世尔科技公司。

1.2 方 法

1.2.1 蔗糖异构酶编码基因PalI密码子优化与全基因合成

在密码子优化网站http://www.kazusa.or.jp/codon/获得解脂耶氏酵母中所有密码子偏好的数据集。根据数据判断密码子偏好性，进行密码子替换，直接将低频密码子替换成高频密码子。将优化后的序列送至上海生工生物工程股份有限公司进行基因合成，合成的片段被亚克隆至pUC57，构成pUC5-PalI。

1.2.2 蔗糖异构酶编码基因PalI表达载体及菌株的构建

采用DNA酶切与连接的方法将蔗糖异构酶编码基因PalI连接到解脂耶氏酵母的表达载体pYLSC上。以合成的载体pUC57-PalI为模板进行基因片段的扩增，引物如表1所示。

表1 PalI基因扩增的引物序列Tab.1 Sequences and functions of primers

用引入XbaⅠ和SfiⅠ酶切位点的上游引物pYLSC-SI-F和下游引物pYLSC-SI-R进行带有酶切位点的编码基因的扩增，PCR反应体系：50 ng pUC57-PalI，10 μL 5×Primer STAR buffer，20 μmol/L引物，2.5 mmol/L dNTPs，1.25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，加水至总体积50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃结束反应。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶回收试剂盒进行基因片段回收。将回收片段与表达载体pYLSC分别进行XbaⅠ和SfiⅠ双酶切，采用凝胶回收试剂盒进行基因片段回收，将回收的线性化质粒与目的片段通过T4 DNA连接酶进行连接，16 ℃反应3 h，将连接产物热激转化至E.coliDH5α感受态细胞中，并涂布于含有终质量浓度100 μg/mL的Amp抗性的LB平板上，挑选阳性克隆进行菌落PCR鉴定。鉴定正确的质粒送至吉林库美生物公司测序。测序正确的质粒命名为pYLSC-PalI。将测序正确的质粒用NotⅠ线性化处理，利用凝胶回收试剂盒进行回收后，用YLEX Expression Kit试剂盒将线性化质粒转入解脂耶氏酵母Y.lipolyticaPo1g感受态细胞中，涂布于YNB平板上，30 ℃培养至出现转化子，挑取阳性转化子提取基因组，PCR鉴定目的片段是否成功整合。

1.2.3 蔗糖异构酶PalI的表达与纯化

挑取鉴定正确的含有目的基因的重组菌Y.lipolyticaPo1g单菌落接入YPD液体培养基中30 ℃、200 r/min进行表达。分别于48、60、72、84 h 取样，84 h后收集发酵液上清，将上清液中带有His标签的PalI利用Ni-NTA填料进行蛋白纯化[15]。将Ni Sepharose 6 Fast Flow填料装入纯化柱(10 cm×0.5 cm)中，使上清液与填料结合2 h后用洗涤液洗涤杂蛋白，直至无杂蛋白流出后，用洗脱液冲洗，收集洗脱下的目的蛋白。蛋白质样品均采用SDS-PAGE电泳进行分析，并用Bradford法测定蛋白质浓度[16]。

1.2.4 蔗糖异构酶PalI酶活力的测定

将100 μL纯化的重组蔗糖异构酶与400 μL 4%蔗糖混匀，40 ℃反应15 min，立即煮沸5 min终止反应，用DNS法进行酶活力测定：150 μL酶解产物加200 μL DNS立即煮沸5 min显色后加入900 μL ddH2O，测定OD540的吸光度，对照为煮沸灭活的酶液。酶活力定义：每分钟生成1 μmoL/L 异麦芽酮糖所需的酶量。

1.2.5 蔗糖异构酶PalI酶学性质表征

1.2.5.1 最适温度及热稳定性

取100 μL纯化的重组蔗糖异构酶PalI与400 μL 4%蔗糖混匀，分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃反应15 min后，立即煮沸5 min终止反应，用DNS测定OD540。以测定出最高的酶活力为100%，得到该酶的温度-酶活力曲线。将酶液分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃温育10 min后测定剩余酶活力，以测定出的最高酶活力为100%，得出该酶的温度稳定性曲线。

1.2.5.2 最适pH及pH稳定性

用不同种类缓冲液分别将纯化的重组蔗糖异构酶的pH调节为3.0、3.5、4.0、4.4、4.7、5.0、5.4、5.7、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0 (pH 3～6缓冲液：0.1 mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠，pH 6～8缓冲液：0.1 mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH 8～9缓冲液：0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷，pH 9～11缓冲液：0.1 mol/L碳酸钠-碳酸氢钠)，取100 μL酶液与400 μL 4%蔗糖混匀，40 ℃反应15 min，立即煮沸5 min终止反应，用DNS法测定各pH下的酶活力。以测定最高的酶活力为100%，得到该酶的最适pH；将酶与不同pH的缓冲液混合，于室温孵育1 h后，在pH 5.7、40 ℃条件下反应15 min测定酶活力，以测定的最高酶活力为100%，计算相对酶活力，得到该酶的pH稳定性曲线。

1.2.6 蔗糖异构酶PalI酶解产物分析

将10 μg蔗糖异构酶PalI与400 μL 4%蔗糖在40 ℃下反应4 h。采用高效液相色谱分析酶解产物，色谱柱采用APS-2氨基柱。柱温设定为35 ℃，10 μL样品，体积流量1 mL/min。采用示差折光检测器进行检测[17]。

2 结果与讨论

2.1 蔗糖异构酶编码基因PalI表达载体及菌株的构建

采用DNA酶切与连接的方法构建pYLSC-PalI表达载体，以pUC57-PalI为模板，PCR扩增蔗糖异构酶编码基因PalI，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。在1 800 bp附近扩增出一条特异性条带，大小与蔗糖异构酶编码基因PalI目的基因片段一致，说明成功扩增蔗糖异构酶编码基因。将双酶切后的表达载体pYLSC与蔗糖异构酶编码基因PalI连接，转化至E.coliDH5α中，涂布于含有氨苄抗性的平板上。从平板上挑取阳性克隆子进行菌落PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，2#～4#及6#～9#鉴定正确。

将菌落PCR鉴定正确的质粒送至吉林库美生物公司测序，结果显示与全基因合成的核苷酸序列完全一致，如图3所示。表明成功构建了含有蔗糖异构酶编码基因PalI的表达载体pYLSC-PalI。将测序正确的pYLSC-PalI质粒用NotⅠ线性化处理，转化至解脂耶氏酵母感受态细胞Y.lipolyticaPo1g后涂布于YNB平板。出现转化子后从平板挑取单菌落，提取基因组，进行PCR鉴定，PCR产物鉴定琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示。2#～5#和7#显示的特异性条带在2 250 bp左右与预测正确条带2 410 bp结果基本一致，说明蔗糖异构酶编码基因PalI成功整合到解脂耶氏酵母基因组中。

1，目的基因条带；M，DNA Marker图1 PCR扩增PalI基因片段的电泳结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of thePalI fragment

1～10，目的基因条带；M，DNA Marker图2 pYLSC-PalI转入E.coli DH5α中的菌落PCR鉴定结果Fig.2 PCR result of pYLSC-PalI/E.coli DH5α

图3 全基因合成PalI核苷酸序列与重组质粒pYLSC-PalI对比结果Fig.3 Sequence alignment of synthesized PalI and the gene from pYLSC-PalI

1，空载；2～7，目的基因条带；M，DNA Marker图4 pYLSC-PalI转入Y. lipolytica Po1g中基因组PCR鉴定结果Fig.4 PCR result of pYLSC-PalI/Y. lipolyticaPo1g recombinants

2.2 蔗糖异构酶PalI的表达及纯化

将鉴定正确的PalI表达菌在YPD液体培养基中30 ℃、200 r/min进行培养及表达。在48、60、72、84 h定时取样，5 000g离心10 min取上清液，SDS-PAGE电泳分析结果如图5所示。结果表明，发酵液上清中有蔗糖异构酶PalI的表达，理论分子质量为70.7 ku，表明PalI能够成功地在Yarrowialipolytica中进行可溶性的外泌表达。将含His标签的PalI利用Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和填料进行纯化，经过结合蛋白、洗涤杂蛋白、洗脱目的蛋白的纯化步骤所获得的PalI纯度较高，SDS-PAGE电泳结果如图6所示。纯化后获得PalI目的条带纯度较高，杂蛋白被有效去除。

重组PalI的纯化结果如表2所示。经Bradford法检测，纯化的PalI质量浓度为0.24 mg/mL。目的蛋白质的回收率为7.9%，纯度大于95%。

1，对照；2～5，发酵液上清；M，蛋白Marker图5 PalI表达在Yarrowia lipolytica发酵液上清SDS-PAGE结果Fig.5 SDS-PAGE result of PalI expressed inYarrowia lipolytica

1，穿刺液；2～3，洗涤液；4，洗脱液；M，蛋白Marker

表2 重组PalI的纯化结果Tab.2 Purification profile of recombinant PalI

当底物为蔗糖时，纯化的PalI酶活力为916.91 U/mg，与以往实验报道的蔗糖异构酶的酶活力(表3)比较，本实验得到酶活力远高于其他蔗糖异构酶的酶活力。

2.3 蔗糖异构酶PalI的酶学性质表征

分别对PalI的最适温度和酶热稳定性进行考察，结果如图7所示。蔗糖异构酶PalI在反应温度为35～50 ℃时具有较高的相对酶活力，当酶反应温度超过50 ℃时，酶活力急剧下降，因此该酶的最适酶反应温度为40 ℃。PalI在温度低于40 ℃时，能够保持稳定的酶活力，随着温度的升高，酶的稳定性下降。

对PalI的最适pH和pH稳定性进行考察，结果如图8所示。PalI在pH为5.7时表现出最大酶活力，pH低于5.0或高于7.0，酶活力急剧下降。PalI在pH 4.0～9.0的缓冲液中室温孵育1 h后，均能够保持稳定的酶活力，当缓冲液pH超过该范围，酶稳定性急剧下降。该结果说明PalI对酸性或碱性环境的耐受范围较广。

表3 已报道的蔗糖异构酶的酶活力Tab.3 The enzyme activity of sucrose isomerase has been reported

2.4 蔗糖异构酶PalI作用于蔗糖的产物分析

利用高效液相色谱对重组蔗糖异构酶PalI与蔗糖反应的酶解产物进行分析，结果如图9所示。与混合标品比较，蔗糖被PalI酶解为果糖、葡萄糖、异麦芽酮糖和海藻酮糖。酶解产物中主产物异麦芽酮糖产量明显高于其他副产物。证明PalI能够高效作用于蔗糖生产异麦芽酮糖，并且副产物中果糖和葡萄糖产量较少。

(a) 最适温度(b) 热稳定性图7 蔗糖异构酶PalI的最适温度及热稳定性Fig.7 The optimum temperature and thermostability of PalI

(a) 最适pH(b) pH稳定性图8 蔗糖异构酶PalI的最适pH及pH稳定性Fig.8 The optimum pH and pH stability of PalI

图9 HPLC分析PalI的酶解产物Fig.9 HPLC analysis of the reaction products of PalI

3 结 论

对来自Klebsiellasp. LX3的蔗糖异构酶编码基因PalI进行密码子优化，构建于解脂耶氏酵母中进行异源表达，发现该酶可溶性表达水平较高。利用亲和层析纯化得到了纯度较高的重组蔗糖异构酶，纯化后PalI酶活力高达916.91 U/mg，远高于以往报道的蔗糖异构酶的酶活力。同时，对纯化的PalI酶学性质进行了分析，该酶最适作用温度为40 ℃，最适pH为5.7，该酶对酸性及碱性环境的耐受力较强，耐受范围较广。高效液相色谱结果分析表明，PalI能够有效作用于蔗糖，将其异构化为异麦芽酮糖及其他少量副产物。