消化系统感染脓毒症血浆中的尼曼-匹克病C2蛋白水平的变化及其作用

徐明珑 王帅伟 白玉 张天月 刘红林 张祎捷 索智敏李伟✉

1 河南大学淮河医院 健康管理中心,河南 开封 475000;2 河南大学淮河医院 转化医学中心脓毒症实验室,河南 开封 475000;3河南大学淮河医院 神经外科,河南 开封 475000;4河南大学淮河医院 消化内科,河南 开封475000

脓毒症是由感染引起的危及生命的器官功能衰竭综合征[1]。据估计,脓毒症在全球范围内每年导致大约1 100 万患者死亡,是人类生命的重大威胁[2]。虽然各种感染均可导致脓毒症,但引发脓毒症的最常见感染性疾病是肺炎,次之为消化器官感染。尽管现在对脓毒症的病理生理机制有了较全面和深入的认识,但目前仍然没有针对脓毒症的有效治疗药物,其主导治疗策略依然是器官功能支持。

尼曼-匹克病C2 蛋白(Niemann-Pick disease type C2 protein,NPC2)是一个由151 个氨基酸形成的小型糖蛋白。研究表明,NPC2在溶酶体和其他细胞器之间未酯化胆固醇的细胞内运输中起关键作用[3-4]。NPC2表达水平的降低在人和啮齿类动物中与肺泡中蛋白沉积及巨噬细胞在肺、肝和脾脏的聚集有关,提示NPC2在多种器官的生理和病理过程中起重要作用[5-6]。但是,NPC2表达缺失所导致的病理变化究竟反映的是细胞内还是细胞外NPC2的功能,目前尚不清楚。

我们之前的研究发现,肺炎和肺炎相关的脓毒症(Pneumonia-associated sepsis,PAS)患者血浆中的NPC2浓度均高于健康者,而PAS患者血浆中的NPC2水平比多脏器功能衰竭患者更高,且与患者的预后有较高的相关性,提示血浆中的NPC2可能在脓毒症的病理进程中起一定的作用[7]。但是,这项研究不能说明NPC2在不同感染疾病患者血浆中的表达水平是否也有相似的变化。更重要的是,目前没有NPC2水平影响脓毒症病理变化的实验证据。在本研究中,我们通过分析NPC2在健康者、消化系统感染非脓毒症(digestive infection,DI)患者和消化系统感染导致的脓毒症(digestive infectioninduced sepsis,DIS)患者血浆中的表达水平,以及在盲肠结扎穿孔引发腹腔感染所导致的脓毒症小鼠中改变血浆中NPC2的浓度对小鼠死亡率的影响,进一步探讨NPC2与脓毒症器官功能障碍的相关性及其在脓毒症病理进程中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

从健康管理中心随机招募了320例身体健康的受试者作为健康对照。根据《第三版脓毒症与感染性休克定义的国际共识》[1]诊断标准,从重症监护病房招募48例DI患者和38例DIS患者。DI和DIS受试者在性别和年龄方面没有发现显著差异。

排除入组患者标准:妊娠、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、白血病、艾滋病或手术。

1.2 血浆样品制备

从每个健康受试者或者消化道感染患者获得一份血样。对于脓毒症患者,在诊断当天和住院期间随机采集血液样本,进行血液收集和血浆制备[7]。简而言之:将血液(2mL)收集到含EDTA 的离心管中,以2 000g离心15 min;然后收集血浆,等分并储存于-80 ℃冰柜中。

1.3 ELISA检测血浆中NPC2水平

NPC2 ELISA 试剂盒,购自Sino Biological(中国北京)。根据制造商提供的方案,使用ELISA(SEK13341,灵敏度范围:156.25～10 000 pg/mL)测定受试者血浆中NPC2浓度。

1.4 脓毒症小鼠模型的建立

选取雄性BALB/c小鼠(9～10周龄)进行盲肠结扎穿刺术(Cecal ligation and puncture,CLP),建立脓毒症小鼠模型。用盐酸艾司氯胺酮(75 mg/kg,肌内注射)和甲苯噻嗪(10 mg/kg,肌内注射)对小鼠进行麻醉;腹部剪毛后,用医用碘伏擦洗腹部进行消毒;用刀片划开腹部中线皮层(约1.5 cm),用剪刀剪开腹部肌肉层(约1.0 cm),暴露盲肠;用3-0医用缝合线在距离盲肠末端2/3处对其进行结扎,并用0.6×25号针头在盲肠末端穿刺;挤出少许内容物后,把盲肠和挤出的内容物一并放回腹内,用缝合钉对伤口进行缝合。手术结束后补充生理盐水(0.5mL)和亚胺培南(0.5 mg/kg),皮下注射。

实验动物分为对照组、低剂量组和高剂量组。三组小鼠在CLP后16 h通过尾静脉分别注射生理盐水或NPC2蛋白,以死亡率为检测指标。其中,低剂量组每只小鼠被注射人或重组小鼠NPC2 蛋白10 ng(0.4μg/kg);高剂量组每只小鼠被注射人或重组小鼠NPC2蛋白50 ng(2μg/kg)。小鼠存活实验观察14 d,每日早晚各记录动物死亡情况1次。

1.5 统计学方法

实验数据采用SPSS 22.0进行处理。连续性计量资料均采用中位数(四分位数间距)表示。使用Mann-Whitney U 检验对两组进行组比较,或使用Kruskal-Wallis ANOVA 检验,然后对多组进行Dunn's检验。使用Kaplan-Meier曲线对小鼠存活进行分析。P＜0.05表示结果差异显著,具有统计学意义。

2 结果

2.1 受试人群的统计学特征

受试人群的基本情况见表1。320例健康者包括男性168例、女性152例,年龄(中位数)为51岁;48例DI患者包括男性20例、女性28例,年龄(中位数)为62岁;38例DIS患者包括男性23例、女性15例,年龄(中位数)为53岁。DI患者与DIS患者的年龄差别没有显著性(P=0.893)。与PAS患者相比[7],消化器官感染导致的脓毒性休克和死亡几率极低。

表1 受试者基本情况

由表2可见,肝胆感染是DI患者和DIS患者最常见的感染,胃肠道感染是DI患者肝胆之后最常见的感染,而胰腺炎是DIS患者第2位常见的感染疾病。

表2 患者感染部位统计

由表3可见,在Charlson comorbidity index包含的并发症中,高龄是最常见的一种。

表3 患者并发症统计

由表4可见,DIS患者器官功能障碍的SOFA平均值为2.92。不同器官的SOFA 依次为:肝脏,1.62;凝血,0.64;肾脏,0.47;肺脏,0.36;中枢神经系统,0.08。值得注意的是,DIS患者都没有发生明显的心功能障碍。

表4 患者器官功能障碍的SOFA结果

2.2 受试人群血浆中NPC2的浓度

与我们和其他研究人员以前的报道相似,健康者血浆中NPC2浓度为0.50(0.32～0.83)ng/mL。我们发现:男性血浆中的NPC2浓度是0.53(0.36～1.04)ng/mL,女性血浆中的NPC2 浓度是0.45(0.27～0.73)ng/mL,男性血浆中的NPC2 浓度比女性的高约16.67%(P=0.006,见图1);30岁以后健康者血浆中的NPC2水平显著高于20～29年龄组(P=0.003～0.017),但与80岁前各年龄组没有显著区别(见图2)。

图1 不同性别受试者血浆中的NPC2水平

图2 不同年龄受试者血浆中的NPC2水平

由于DI和DIS患者年龄较高,我们选择了71位年龄与DI和DIS患者年龄匹配的健康者(中位数为63岁,四分位区间为60～68岁),确定其血浆中的NPC2浓度为0.53(0.35～0.83)ng/mL。而DI患者血浆中的NPC2浓度为0.89(0.59～2.07)ng/mL,显著高于健康者(P=0.003,见图3)。DIS患者血浆中的NPC2 浓度为1.90(0.99～5.27)ng/mL,不仅显著高于健康者(P＜0.001),而且比DI患者高出1倍以上(113%,P=0.0015,见图3)。如果将DIS患者按器官功能障碍程度(SOFA 评分)分组,血浆中的NPC2浓度随着器官功能障碍的加重呈上升趋势(见图4)。血浆中的NPC2浓度的升高似乎与特定脏器的衰竭程度没有直接关系。比如NPC2浓度在有和无肝、肾或者凝血障碍的DIS患者血浆中没有显著区别(P＞0.05)。

图3 年龄(中位数为63岁)匹配的受试者血浆中的NPC2水平

图4 脓毒症器官功能障碍患者血浆中的NPC2水平

2.3 重组NPC2蛋白对脓毒症小鼠的存活率的影响的影响

一只小鼠有全血约1.5～2.0mL,体重约22～25 g(相当于体积20～25mL)。根据NPC2血浆的浓度,我们在引发腹腔感染16 h后通过尾静脉分别注射10 ng和50 ng重组人或者小鼠NPC2蛋白,然后每天观察小鼠存活情况。结果显示,各组小鼠的最终死亡率为35%～50%,相互之间无统计学意义。提示无论是人或者是小鼠NPC2蛋白,都对脓毒症小鼠的14 d存活率没有显著影响(P＞0.05,见图5、图6)。

图5 重组人NPC2蛋白对脓毒症小鼠存活的影响

图6 重组小鼠NPC2蛋白对脓毒症小鼠存活的影响

3 讨论

在研究中我们发现,DI患者血浆中的NPC2浓度显著高于健康者,而DIS患者血浆中的NPC2水平则进一步升高。但是,提高脓毒症小鼠血浆中NPC2浓度似乎对小鼠的预后没有明显影响。

脓毒症是感染引起的器官功能障碍综合征[1],不同部位的感染都能导致脓毒症。下呼吸道感染(主要是肺炎)在发达国家是最常见的引发脓毒症的感染性疾病,而在发展中国家消化系统感染则更为常见[2,8]。但是,不管是在发达或者发展中国家,导致脓毒症患者死亡的感染疾病以肺炎最为常见[2,8]。我们的前期研究发现,PAS患者病死率超过50%[7]。而在本研究中,DIS 患者的病死率仅5%。虽然本研究涉及的病例数远低于前期研究涉及的PAS患者病例数,但两类脓毒症患者病死率的巨大差别强烈提示PAS的预后较差。这个现象与其他研究人员的报道一致,即PAS死亡人数远高于其他感染所导致的脓毒症患者的死亡人数[2]。导致这个现象的具体原因尚不清楚,一种可能的解释是DIS患者的病情较轻。在本研究涉及的DIS患者在消化内科接受治疗,其SOFA 平均值为2.92。而我们前期研究的PAS患者多数在呼吸重症病房接受治疗,其SOFA 平均值为7.67[7]。可见受试PAS患者的器官功能障碍评分,即病情严重程度,远高于DIS患者,因此可能导致病死率的明显区别。

DIS与PAS 患者的另一个区别是NPC2 在DIS患者对器官功能障碍的敏感度较高。在PAS患者,血浆中的NPC2 浓度在SOFA 评分达到14后才显著高于非脓毒症患者[7]。而在DIS 患者,SOFA 达到4分时血浆中的NPC2 浓度(3.08 ng/mL)即显著升高(与SOFA=1 的患者相比P=0.009)。导致这个现象的原因尚不清楚。虽然有研究提示肝脏可能是血浆中NPC2 的主要来源[9-10],但我们对PAS患者的研究提示NPC2的升高与肝脏蛋白合成的活动程度没有关系[7]。在本研究中,血浆中的NPC2水平似乎与肝、肾或凝血障碍的发生没有显著关系。因此,脓毒症患者血浆中的NPC2水平升高可能与消化器官感染的关系更为密切,但其直接原因仍待进一步探讨。

血浆中的NPC2水平与脓毒症器官功能障碍的相关性提示NPC2可能参与脓毒症的病理进程。据此,我们使用小鼠盲肠结扎穿孔引发的脓毒症模型,检测了重组NPC2蛋白对小鼠存活率的影响。意外的是,不管是重组人或者小鼠NPC2蛋白都没有显著改变脓毒症小鼠的死亡率。这个结果提示,血浆中NPC2浓度的升高可能是脓毒症患者脏器损伤的结果,而不是脏器损伤或者功能障碍的原因。当然,我们并没有在本研究尝试更多的干预时间,也没有在更大范围地测试NPC2蛋白的剂量,而且小鼠和人存在巨大的种属差异,所以这个结论还需要进一步验证。