两株芽孢杆菌对茶用菊红心菊生长和品质的影响

罗孟婷 方馨妍 葛礼姣 管志勇 陈素梅 房伟民 陈发棣 赵 爽

(南京农业大学园艺学院/华东地区花卉生物学国家林业和草原局重点实验室，江苏 南京 210095)

菊花(Chrysanthemummorifolium)起源于我国，栽培历史悠久，种植广泛，具有较高的观赏价值及经济价值[1]。除观赏栽培外，茶用菊因含有黄酮类化合物、挥发油成分、绿原酸等多种抑菌、抗氧化及抗肿瘤成分[2-3]，成为深受人们欢迎的健康保健饮品，市场需求日益增加。然而，随着茶用菊栽培面积的不断扩增以及种植年限的累积，茶用菊栽培土壤环境日益恶化，营养元素比例日渐失衡，根系有害分泌物连年积累导致茶用菊植株矮化、叶片腐烂、花型畸变等，严重影响茶用菊花生长及品质[4-5]，即便存活也不能作为商品出售。

植物根际中存在着数量庞大、种类繁多的微生物，其中植物根际促生细菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)能够在根际定殖[6]，且具有促生[7]、协助植物抗逆[8-9]或生防[10-11]等功能，可以直接或间接地促进植物的生长和发育[12-14]。目前，已鉴定出的PGPR菌株包括芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)和黄单胞菌属(Xanthomonas)等[15]。其中，芽孢杆菌属菌株是一类重要的菌种资源，在生物肥料和生物农药等领域受到广泛关注[16]。杨晓云等[17]通过盆栽试验研究表明，不同稀释倍数的解淀粉芽孢杆菌上清液均对番茄生长具有显著促生作用；张德珍等[18]通过发芽试验和盆栽试验研究，发现解淀粉芽孢杆菌可以促进种子萌发和幼苗生长；叶如梦等[19]通过在不同土壤条件下接种枯草芽孢杆菌，发现土壤条件虽然在一定程度上会限制枯草芽孢杆菌的促生能力，但无论贫瘠组还是营养组均能促进香蜂花的生长。此外，PGPR菌株不仅对环境具有较高的敏感性，而且与宿主之间存在特异性[20]。

茶用菊作为我国独特的功能性菊花，相关研究以我国为主，国外鲜有茶用菊品种或栽种技术的报道。以往，我国有关茶用菊的研究多集中在品种选育[21]与花期、产量[22]等生产特性方面，而关于PGPR菌株在茶用菊绿色高效栽培中的研究鲜有报道。南京农业大学菊花实验室从不同菊花根际土壤中筛选到两株根际细菌，经鉴定分别为枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，本研究拟通过大田试验，进一步研究其对茶用菊的促生作用，以期为今后茶用菊优质绿色栽培提供理论依据及技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验地概况

试验于2020年7月至11月在南京农业大学中国菊花种质资源保存中心进行。供试材料为茶用菊红心菊，由南京农业大学中国菊花种质资源保存中心提供。试验地土壤pH值5.15，可溶性盐浓度值(the value of electrical conductivity, EC)100 μS·cm-1，铵态氮含量68.95 mg·kg-1，速效钾含量97.90 mg·kg-1，速效磷含量59.55 mg·kg-1。

1.2 供试菌株分离与纯化

从不同地域菊花栽培田采集菊花植株及根际土壤，参照赵佳淼[23]的方法分离菌株。分离获得的2株菌株枯草芽孢杆菌(Bs)和解淀粉芽孢杆菌(Ba)在LB固体培养基上重复划线纯化菌株。参照《伯杰细菌鉴定手册》[24]进行菌落外观形态鉴定。挑取单菌落于LB液体培养基中过夜培养，摇床温度为37℃，转速为200 r·min-1，培养至OD600为1.0，提取菌株的总DNA用于16S rDNA基因PCR扩增。正向引物F357：5′-C C T A C G G G A G G C A G C A G-3′；反向引物R518：5′-A T T A C C G C G G C T G C T G G-3′。PCR反应体系(20 μL)：Taq PCR Master Mix(2×，with Blue Dye)10 μL，F357(10 μmol·L-1)1 μL，R518(10 μmol·L-1)1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸15 s，34个循环；72℃终延伸 5 min。扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳，然后送至通用生物系统有限公司测序。将得到的16S rDNA基因序列在国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)进行比对，并使用Mega-X构建菌株的遗传系统发育树。

1.3 菌株悬液制备及试验方法

将-80℃甘油管保存的菌株Bs和Ba在LB固体培养基上划线活化，37℃、200 r·min-1过夜培养，翌日吸取适量菌剂至新鲜LB液体培养基中扩大培养10～12 h，用血球计数板计数，4℃保存备用。

供试植株扦插苗在穴盘中培养，15 d后生根时，选择健康、长势一致的扦插苗移栽到大棚中。移栽时，采用灌根接种的方法处理植株，接种菌剂浓度约为1.0×108CFU·mL-1。试验共设4个处理：以未接种的LB培养液为空白对照(CK)，根际接种Bs菌株处理组(Bs)，接种Ba处理组(Ba)，混合接种Ba和Bs处理组(Ba+Bs)，每个处理设50株重复，共计200株，常规栽培管理。每隔30 d对红心菊进行外观形态指标、根系指标、花期产量及品质指标等生理指标测定。外观形态指标株高、茎粗、冠幅的测定方法参照文献[22]；植株洗净吸干水分后测定鲜重，于37℃烘箱中烘干至恒重后测定干重；根系指标通过STD 4800根系扫描仪(Epson，印度尼西亚)进行测量；花期采摘鲜花烘干后测定总黄酮、绿原酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量，测定方法参照文献[21]；估产量为50株试验苗的总产量。

1.4 统计与分析

试验数据用Excel 2010软件进行数据初步统计与整理，采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析和差异显著性检验(Duncan法，P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 菌株形态及分子鉴定

菌株Ba和Bs在LB固体培养基上生长状态良好。Ba菌落颜色呈淡黄色不透明，表面有隆起，边缘不规则；Bs菌株菌落颜色呈黄色不透明，表面粗糙，边缘不规则(图1)。

图1 菌株Ba和Bs在LB培养基正反面的生长状态

为进一步确定菌株的种类，对两株芽孢杆菌进行PCR扩增和测序，测序所得结果在NCBI进行序列比对，发现菌株Ba与Bacillusamyloliquefaciensstrain DGL1(CP065539.1：2923783-2923947)的相似性高达94%，菌株Bs与Bacillussubtilisstrain PCK054(MN913819.1：185-342)的相似性高达98.73%，结合菌体形态鉴定菌株Ba为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，菌株Bs为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(图2)。

图2 16s rDNA基因序列菌株Ba和菌株Bs的系统发育树

2.2 接种芽孢杆菌Ba和Bs对茶用菊红心菊外观形态指标的影响

由图3可知，接种解淀粉芽孢杆菌(Ba)和枯草芽孢杆菌(Bs)后，红心菊植株与CK相比在株高、冠幅、根系生长等方面表现出更好的长势，且Ba+Bs处理的植株长势优于Ba和Bs处理。

图3 接种芽孢杆菌Ba、Bs和Ba+Bs对红心菊生长的影响

接种芽孢杆菌处理对茶用菊红心菊植株外观指标有促进作用。由表1可知，苗期时，芽孢杆菌菌剂对茶用菊植株有不同程度的促进作用，Ba处理后植株株高最大，与CK相比增加了21.44%，Bs处理的植株茎粗最大，较CK增加22.99%，而Ba+Bs混合菌剂处理整体表现优于单一菌剂接种处理，与CK相比，植株冠幅、地上部鲜/干重、地下部鲜/干重分别增加25.23%、86.64%、161.72%、128.57%、80.00%。生长期时，Ba、Bs以及Ba+Bs处理组的植株株高、冠幅、地上部鲜/干重较CK均有显著提高，只有Ba+Bs混合菌悬液处理对植株地下部鲜重提高作用显著，较CK提高了28.44%。花期时，Ba、Bs和Ba+Bs菌悬液处理的植株株高和冠幅与CK相比有显著性差异，株高较CK分别提高了19.66%、19.51%、21.75%，冠幅分别增长了23.92%、38.17%、51.74%，Ba+Bs处理组结果更优，同时发现仅Ba+Bs处理的植株地上部鲜重和干重与CK相比具有显著性差异，分别增加53.89%和57.79%。

表1 接种Ba、Bs和Ba+Bs对红心菊外观指标的影响

2.3 接种芽孢杆菌Ba和Bs对红心菊根系指标的影响

Ba、Bs和Ba+Bs处理对红心菊根系指标表现出不同的促进作用(表2)。苗期时，分别接种Ba、Bs和Ba+Bs后，与CK相比，红心菊植株总根长、总根表面积增加90%以上，根平均直径增加27%～54%，总根体积增加130%以上，根尖数增加124%～206%，表现出较好的促进生长作用。生长期时，除根平均直径外，Ba、Bs和Ba+Bs菌悬液处理后植株总根长、总根表面积、总根体积、根尖数与CK相比显著增加，表明接种Ba、Bs和Ba+Bs菌悬液对红心菊根系具有纵向促生长作用，其中Ba+Bs和Bs处理对植株总根长和总根表面积的促生长作用显著高于Ba处理。与CK相比，Ba+Bs和Bs处理使总根长分别增加73.36%、60.78%，总根表面积分别增加73.36%、60.81%，Ba+Bs混合菌剂处理对总根体积的促生作用表现最优，增加46.62%，而Bs菌剂处理对根尖数的促生作用表现最优，增加1 012.89%。现蕾期时，Ba菌悬液处理后植株各项根系指标与CK相比均差异显著，总根长、总根表面积、总根体积、根平均直径和根尖数分别增加79.52%、74.35%、170.39%、78.76%和546.73%；Bs处理根系各项指标与CK相比无显著差异；Ba+Bs处理对红心菊总根长、总根表面积和根尖数影响最大，与CK相比分别增加96.33%、90.69%、1 339.23%。花期时，Ba和Ba+Bs菌悬液处理对红心菊根平均直径影响显著，与CK相比，平均根直径分别增加了52.47%和45.29%，表现出了较明显的横向促生作用。

表2 接种Ba、Bs和Ba+Bs对红心菊根系指标的影响

2.4 接种芽孢杆菌Ba和Bs对红心菊产量的影响

接种Ba、Bs和Ba + Bs混合菌悬液对红心菊产量影响显著(表3)。与CK相比，Ba、Bs和Ba+Bs处理后，红心菊单花直径分别增加了8.10%、7.70% 和5.51%；单花鲜/干重显著增加，Bs菌剂处理后单花鲜重和单花干重分别达到了1.50和0.21 g，与CK相比分别增加了35.14% 和61.54%，而Ba和Ba+Bs处理后植株单花鲜重仅分别增加16.22%、18.92%。Ba、Bs和Ba+Bs菌悬液处理的红心菊植株单株花数较CK分别增加31.07%、38.41%、111.29%，估产量分别增加53.54%、88.62%、152.00%，其中Ba+Bs处理后植株单株花数和估产量与其他处理表现出了显著差异，说明该处理具有更好的可应用性。

表3 接种Ba、Bs和Ba+Bs对红心菊产量的影响

2.5 接种芽孢杆菌Ba和Bs对红心菊品质的影响

Ba、Bs和Ba + Bs混合菌悬液处理后红心菊花朵中绿原酸、木犀草苷和3，5-二咖啡酰基奎宁酸含量与CK相比差异显著(图4)。2020版《中华人民共和国药典》[25]规定，按菊花干燥品计算，绿原酸含量不得少于0.20%，木犀草苷含量不得少于0.08%，3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量不得少于0.70%。经测定，CK红心菊花朵中绿原酸含量仅为0.12%、木犀草苷含量为0.04%、3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量为0.44%，均低于中国药典标准。

图4 接种Ba、Bs和Ba+Bs对红心菊茶用品质的影响

CK红心菊花朵中总黄酮含量为48.22 mg·g-1，而Ba+Bs处理后花朵中总黄酮含量为55.76 mg·g-1，提高了15.64%，在3个菌剂处理中增长率最高。Bs处理后花朵中绿原酸含量最高，较CK升高0.03个百分点；Ba处理后花朵中木犀草苷含量最高，较CK升高0.008个百分点；Ba、Bs以及Ba+Bs菌悬液处理的花朵中3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量分别为0.55%、0.57%、0.56%，均未达到药典标准，但与CK之间差异显著，各处理3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量分别增长0.10、0.12、0.11个百分点。以上结果表明，Ba、Bs和Ba+Bs可以提高茶用菊红心菊茶用品质，提高幅度可达到20%以上，为改善茶用菊红心菊品质提供了可能性。

3 讨论

在根际微生物的促生研究中，菌株在实际应用中的效果是评价其促生作用的重要指标。本试验结果表明，接种解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对红心菊均有促生效果。

解淀粉芽孢杆菌是一类重要的生防菌株，同时也是重要的植物根际促生菌株[26-29]。已有研究证实，解淀粉芽孢杆菌在番茄[17]、黄瓜[18]、草莓[30]、玉米[31]、水稻[32]等作物上都有显著的促生作用，王华笑[31]发现解淀粉芽孢杆菌YM6可显著提高玉米的生长指标和产量；徐瑛等[33]发现藜麦经过解淀粉芽孢杆菌处理后茎长、鲜干重显著增加；李晴晴等[32]通过大田试验发现经解淀粉芽孢杆菌FH-1处理后水稻的株高、穗长、单株穗数等均显著提高。本研究结果表明，接种解淀粉芽孢杆菌Ba后，茶用菊红心菊的株高、冠幅、茎粗、地上部鲜干重、地下部鲜干重等指标均有所提高，与前人研究结果一致，且Ba在苗期时对红心菊促生效果最为显著，表明根际促生菌可能是通过改善植株幼苗的营养吸收能力，进而提高植株各生长指标和花期产量。

枯草芽孢杆菌是中国农业部门批准的益生菌[34]，因为易于大量培养而被广泛应用，已有研究表明其对苦瓜[35]、番茄[36]、花生[37]、马铃薯[38]、向日葵[38]等农作物均有促生作用，秦健等[35]发现根施8×105CFU·mL-1浓度的枯草芽孢杆菌可促进苦瓜茎粗、叶片数、叶绿素含量、全氮、全钾、全磷含量显著增加；刘秀梅[36]发现枯草芽孢杆菌可显著提高番茄的株高和产量。本研究结果表明，单施枯草芽孢杆菌Bs后，红心菊的生长指标均有所提高，接种Bs菌株浓度为108CFU·mL-1时，对红心菊植株株高、茎粗、冠幅、地上部鲜/干重的促生作用显著高于CK和Ba处理。Bs处理植株在苗期时促生作用最为显著，说明通过苗期灌根接种的方式可以将枯草芽孢杆菌成功定殖到植株体内，促进幼苗根系生长速度，有利于植株充分的吸收水分和营养物质，同时提高苗期植株的抗逆性，保障植株良好的生长状态，最终达到增产的目的[19]，杨倩倩[37]已在花生这一植株中证实枯草芽孢杆菌可以通过提高土壤中有益菌数量同时减少病原菌数量来改善植物根际生态环境，提高植株根系活力。

混合使用促生菌株可以更有效地激发土壤中有益微生物活性，实现多种促生菌功能互补、作用持久的协同促生效果[39]。Saini等[39]通过4种不同菌株的组合试验发现，混合菌剂对于勋章菊的促生效果大于单一菌剂。本研究结果表明，Ba+Bs处理对红心菊冠幅、地上部鲜干重指标促生作用表现最好，对红心菊产量和茶用品质的影响也优于单施Ba和Bs，Ba+Bs处理后植株的估产量与CK相比，增长率达到了152.00%，花朵中总黄酮含量提高了15.64%，显著高于Ba与Bs处理，与肖开兴等[41]的研究结果一致，表现出了多菌株接种的促生优势。此外Ba+Bs处理与Ba、Bs处理结果一样，均为生长初期促生作用最显著，菌剂处理后的红心菊根尖数显著增加，表明根际促生菌可通过促进侧根的生长和根毛的形成来促进植物地上部生长，与在拟南芥和小叶锦鸡儿上的研究结果一致[42-43]。随着茶用菊红心菊的生长发育，菌剂接种处理对植株地下部鲜干重、各项根系指标和根尖数的影响逐渐减小，进一步说明根际促生菌株主要通过影响幼苗初期根系的生长发挥作用，也可能与随着处理时间的延长接种菌株的定殖量逐渐减少有关[44]。

一般来说，随周围环境因素的改变，植物体内会产生相应的化学物质，最终导致植物品质发生变化。孔留利等[45]研究表明接种菌株S61可促进毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花苷在黄芪根中的积累；撒多文等[46]研究表明接种根瘤菌之后苜蓿中可溶性蛋白含量增加；李昌宁等[47]研究发现分离出的假单胞菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属菌株能有效改善植株品质，猜测可能是由于根际促生菌株可以促进粗蛋白和粗脂肪的合成，同时抑制酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维合成，在显著提高植株产量的同时，也能有效改善植株品质。2020版《中国药典》[25]指出菊花头状花序中的绿原酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰基奎宁酸、总黄酮以及各种维生素、氨基酸等是衡量菊花质量标准所依据的重要指标，本研究结果表明，Ba、Bs和Ba+Bs处理后红心菊花朵中的总黄酮、绿原酸、木犀草苷以及3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量均有不同程度的增加，与CK相比，绿原酸、木犀草苷以及3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量可提高20%以上，与前人研究结果一致，结合上述生长指标变化表明根际促生菌株可以通过一系列复杂的机制影响植物营养元素的积累，进而影响植株品质。

4 结论

本研究通过系统地开展茶用菊红心菊全生育期的田间试验，明确了两株菊花根际土壤分离出的芽孢杆菌Ba与Bs对茶用菊红心菊的促生作用。研究结果表明，在茶用菊苗期栽培土壤中混合接种解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(Ba+Bs)可以显著提高红心菊的外观品质、花期产量以及茶用品质，为今后充分利用根际微生物资源优势奠定了先期基础。植物根际促生细菌促生作用机制包括直接作用和间接作用，具有一种或多种促生特性，因其来源、寄主及环境的差异而促生机理不同，后续研究将进一步探究上述菌株在茶用菊根际的定殖特性，辅以代谢组学手段解析其对茶用菊促生的作用机制，以期为茶用菊绿色高效栽培提供理论依据。