一测多评法同时测定葆肾合剂中5种成分的含量

冯子芳 费逸明 袁晓航 陈晓伟 胡敏敏 刘丽萍

[摘要]目的建立一测多评（QAMS）法同时测定葆肾合剂中绿原酸、咖啡酸、意苡素、鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷5种成分的含量。方法选取Waters XBridge C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙睛（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱。以绿原酸为内参物，建立相对校正因子，计算其含量，比较外标法与QAMS法的差异性。结果绿原酸、咖啡酸、意苡素、鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷在范围内线性关系良好（r≥0.9996），不同实验条件下相对校正因子重现性良好，一测多评法与外标法测得值之间无显著性差异（RAD<2%）。结论建立的一测多评法准确、重复性好，可用于葆肾合剂中5种活性成分的同时测定，实现质量控制。

[关键词]一测多评法;葆肾合剂;相对校正因子;质量控制

[中图分类号]R286.0    [文献标识码]A    [文章编号]2095-0616（2022）01-0051-05

Simultaneous determination of five ingredients in Baoshen mistura by quantitative analysis of multi-components by single marker

FENG Zifang1    FEI Yiming1    YUAN Xiaohang1    CHEN Xiaowei1    HU Minmin1    LIU Liping2

1. Wuxi Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Wuxi 214000，China;2. Jiangsu Vocational College of Medicine，Jiangsu，Yancheng 224005，China

[Abstract]Objective To establish a quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS）method for the simultaneous determination of chlorogenic acid，caffeic acid，coixol，ellagic acid and mullein isoflavone glucoside in Baoshen mistura. Methods A Waters XBridge C₁ column （250 mm×4.6 mm，5 μm）was selected with the mobile phase of acetonitrile （A）- 0.2% phosphoric acid water （B），and the gradient elution was performed. The chlorogenic acid was used as the internal reference，and the relative correction factors were set for the calculation of the content of chlorogenic acid，and the differences between the external standard method and QAMS method were compared. Results The chlorogenic acid，caffeic acid，coixol，ellagic acid and mullein isoflavone glucoside showed good linearity within a certain range （r≥0.9996）. There was a good reproducibility in the relative correction factors under different experimental conditions，and there was no significant difference in the values measured by the QAMS method and the external standard method （RAD<2%）. Conclusion The established QAMS method is accurate with good reproducibility，which can be used for the simultaneous determination of the five active ingredients in Baoshen mistura to achieve quality control.

[Key words]Quantitative analysis of multi-components by single marker;Baoshen mistura;Relative correction factor;Quality control

葆肾合剂是无锡市中医医院治疗早中期慢性腎脏病的基本方，处方由芡实、覆盆子、黄芪、米仁根、僵蚕、金樱子、石韦7味中药组成，功能健脾益肾、清热利湿，临床疗效较好[1]。中药制剂的特点是多成分、多靶点，如果只测定某一成分，很难准确地评价其质量[2-4]，—测多评法（QAMS）通过选择某一质量稳定、对照品价廉易得、临床疗效确切的组分作为内参物，实现对该制剂所含多个组分同时测定的目的。本试验以葆肾合剂为研究对象，以绿原酸为内参物，建立其他成分与其的相对校正因子[5]，进行定量计算，为全面控制制剂质量，保证临床疗效奠定基础[6-7]。

1    仪器与试药

1.1    仪器

BSA224S-CW电子天平（德国Sartorius公司）;Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司），DAD二极管阵列检测器（美国Agilent公司）;DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）;KQ-100型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司，功率：100W，频率：40 kHz）。1.2    试药

试验用七味药材，经副主任中药师鉴定合格，并且均由苏州天灵中药饮片有限公司提供;薏苡素对照品（批号：J24M10L89214，供含量测定用，纯度≥98%）;咖啡酸对照品（批号：W16010B100366，供含量测定用，纯度≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司;绿原酸对照品（批号：110753- 201817，供含量测定用，纯度96.8%），鞣花酸对照品（批号：111959-201602，供含量测定用，纯度98.3%）;毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号：111920-201606，供含量测定用，纯度97.6%）均购自中国食品药品检定研究院;水为超纯水;乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）;其余试剂均为分析纯。

试验中用到的样品溶液，是制剂室根据处方，加10倍量水，浸泡30 min，每次煎煮2 h，煎煮3次，制成每瓶200 ml，共10个批次，批号分别为：20201221，20201222，20201223，20201224，20201225，20201226，20201227，20201228，20201229，20201230。

2    方法与结果

2.1    色谱条件[8]

色谱柱：Waters XBridgeC₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱温30℃;检测波长分别为326 nm （0～26 min：检测绿原酸、咖啡酸、薏苡素）和254 nm（26～65 min：检测鞣花酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷），流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）;梯度洗脱（0～10 min，92%B;10～12 min，92%B～89%B;12 ～50 min，89%B;50～65 min，89%B～80%B）;进样体积10 μl;流速1.0 ml/min;分析时间65 min，色谱图见图1。

2.2    混标的制备[9]

以甲醇为溶媒，分别精密称取咖啡酸、绿原酸、鞣花酸、毛蕊异黄酮葡萄糖昔和薏苡素对照品适量，制成每毫升含咖啡酸1.56 mg、绿原酸3.50 mg、鞣花酸0.84 mg、毛蕊异黄酮葡萄糖昔2.35 mg和慧苡素1.20 mg的溶液，摇匀，备用。

2.3    供试品溶液的制备

精密吸取10批样品溶液各1.5 ml，置于5 ml容量瓶中，加甲醇，超声10 min，放冷后定容，摇匀，微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

2.4    阴性对照溶液的制备

参照葆肾合剂的处方，制备缺石韦、米仁根、金樱子、覆盆子和黄芪的阴性样品，依据“2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.5    方法学考察[9]

2.5.1    线性关系考察    精密吸取“2.2”项下适量混标溶液，加甲醇稀释成不同浓度，微孔滤膜滤过，分别吸取10 μl注入液相色谱仪，记录峰面积。以各对照品峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），得到如下线性方程：绿原酸为Y=8.590X+85.662，r=0.9998，线性范围6.99～135.21 μg/ml;咖啡酸为Y=27.539X+96.017，r=0.9996，线性范围3.35～61.26 μg/ml;薏苡素为Y=9.153X-2.534，r=0.9999，线性范围4.00～46.44 μg/ml;鞣花酸为Y=97.778X-62.964，r=0.9999，线性范围1.81～33.13 μg/ml;毛蕊异黄酮葡萄糖苷为Y=21.464X+13.772，r=0.9998，线性范围5.03～91.88 μg/ml，在上述范围内线性关系良好。

2.5.2    精密度试验    精密吸取“2.2”项下混标溶液，按照色谱条件，连续进样6次，记录咖啡酸、绿原酸、鞣花酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和薏苡素的峰面积，结果RSD值分别为1.43%、0.32%、0.49%、0.64%和0.51%，表明精密度良好。

2.5.3    重复性试验    参照“2.3”项下方法，取葆肾合剂样品溶液（批号：20201225），平行制备6份供试品溶液，进样检测，记录咖啡酸、绿原酸、鞣花酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和薏苡素的峰面积，结果RSD值分别为1.84%、1.34%、2.07%、2.51% 和0.59%，表明重复性良好。

2.5.4    稳定性试验    取葆肾合剂样品溶液（批号：20201225），分别在0、1、2、4、8、16 h进样，记录峰面积，结果咖啡酸、绿原酸、鞣花酸、毛蕊异黄酮葡萄糖昔和薏苡素峰面积的RSD值分别为1.54%、0.97%、2.14%、0.86%和1.77%，表明16 h內稳定性良好。

2.5.5    加样回收率试验    按葆肾合剂样品溶液有效成分含量1：1的比例，精密加入混标溶液，平行制备6份供试品溶液，进样分析。结果咖啡酸、绿原酸、鞣花酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和薏苡素的平均加样回收率（RSD值）分别为97.15%（1.28%）、98.46%（1.36%）、102.17%（2.44%）、96.88%（2.36%）和99.06%（2.59%）。

2.6    测定相对校正因子（RCF）[10]

精密吸取混标溶液，进样分析，以绿原酸为内参物，按照RCF计算公式（1），分别计算咖啡酸、薏苡素、鞣花酸和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的相对校正因子RCF。

f_k/s=f_k/f_s=（C_k×A_s）/（C_s×A_k）（1）

式中Ak为内参物峰面积，Ck为内参物的质量浓度，As为目标成分的峰面积，Cs为目标成分的质量浓度，见表1。

2.7    相对校正因子耐用性考察

取混标溶液，进样检测，记录峰面积，考察2个品牌的高效液相色谱仪：Agilent 1200型和Waters e2695 型，3 种色谱柱：YMC-Pack ODS-AC₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）;Agilent Eclipse XDB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters XBridgeC₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）对RCF的影响，见表2。

2.8    待测组分色谱峰的定位[11]

采用相对保留时间值法对待测成分绿原酸、咖啡酸、薏苡素、鞣花酸和毛蕊異黄酮葡萄糖昔色谱峰进行定位，以内参物绿原酸色谱峰为基准峰，考察不同仪器、不同色谱柱条件下5种成分色谱峰的相对保留时间值，见表3。

2.9    含量测定

取10批样品溶液，进样分析，记录峰面积，分别采用外标法（ESM）和一测多评（QAMS）法计算待测目标成分的含量，并进行比较，两种方法所测结果的偏差（RAD）均<2.0%，见表4。

3    讨论

3.1    指标性成分的确定

葆肾合剂是由芡实、黄芪等7味药材制成的复方制剂，芡实为制剂中的君药，主要含有碳水化合物（82.6%）[12];黄芪主要活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷，具有抗损伤、免疫调节等功效[13];米仁根有效成分薏苡素，具有清热利湿、健脾和杀虫等功效[14];金樱子、覆盆子“益肾脏而固精”，其所含的鞣花酸具有良好的抗炎和抗菌作用等[15-16];石韦甘苦微寒，其中绿原酸有降压等作用，咖啡酸能抗炎抗病毒[17]，助米仁根清利湿热为佐药，故选择这几个作为指标成分进行定量控制。

3.2    色谱峰定位及系统耐用性的考察

对于色谱峰定位，以绿原酸为基准峰，对各待测成分色谱峰，采用相对保留时间值（待测成分与内参物保留时间之比）进行定位，结果待测成分的相对保留时间RSD值均<3%，色谱峰出峰先后顺序没有变化，表明稳定性较好，可用于色谱峰的定位[18-19]。

4    小结

课题组前期已进行指纹图谱的相关研究[20]，本试验采用高效液相色谱法建立葆肾合剂一测多评（QAMS）的含量测定方法，方法稳定，简便可行。一测多评法（QAMS）是选择一种成分作为内参物，同时测定多个成分，最终实现中药整体质量的控制，目前已经用于中药材、中药饮片及中药制剂的成分测定。

葆肾合剂为无锡市中医医院肾病科的经验方，有着良好的临床疗效和应用前景，本试验建立了同时测定葆肾合剂中5种成分的一测多评法（QAMS），对其耐用性进行考察，将一测多评法计算的含量与外标法所测得含量值，采用相对平均偏差进行比较（RAD<2%），无显著差异，表明该方法简便准确，重复性好，可实现5个成分的定量测定，符合中药多组分特点的质量评价模式[21]，可以有效用于葆肾合剂的质量控制。但由于条件受限，有些成分未能测定含量，未来将进一步完善该品种含量测定研究。

[参考文献]

[1]姬雪雪，马济佩.肾炎胶囊联合葆肾合剂治疗慢性肾炎的临床疗效观察[D].南京：南京中医药大学，2019：2-10.

[2]董秋菊，周园，冯薇，等.指纹图谱结合一测多评法在五子衍宗丸质量评价中的应用[J].中药材，2019，42（3）：579-583.

[3]陆兔林，石上梅，蔡宝昌，等.基于一测多评的中药多成分定量研究进展[J].中草药，2012，43 （12）：2525-2529.

[4]Arceusz A，Wesolowsk M.Quality consistency evaluation of Melissa officinalis L.commercial herbs by HPLC fingerprint and quantitation of selected phenolic acids[J].J Pharm Biomed，2013，83Z：215-220.

[5]张佳，田丽，晓青.基于一测多评法对保喉片中8种成分的质量控制研究[J].中国现代应用药学，2021，38（1）：55-62.

[6]袁芳杰，吴明波，谭丙寅.一测多评法同时测定肾舒颗粒中9种成分[J].中成药，2019，41（12）：2848-2853.

[7]孙庆文，潘国吉，徐文芬，等.一测多评法测定小花清风藤中5种黄酮类成分的含量[J].中药材，2019，42（12）：2861-2867.

[8]邓艳梅，徐建.一测多评法同时测定乳癖消片中5种指标性成分的研究[J].中国药师，2020，23（1）：179-182.

[9]张洁，许有诚，林丹，等.一测多评法测定不同基原天南星中4种化学成分含量及质量评价研究[J].中药材，2020，42（1）：141-144.

[10]杨文惠，罗宇琴，孙冬梅，等.一测多评法测定不同产地紫苏子中4种活性成分的含量[J].中国现代中药，2020，22（6）：884-889.

[11]吴娇芬，崔慧芳，张为，等.一测多评法测定杧果叶化学成分的含量[J].中药材，2020，43 （2）：398-401.

[12]王红，吴启南，伍城颖，等.高效液相色谱法测定芡实中不同構型维生素E的含量[J].食品工业科技，2014，35（8）：74-78.

[13]姜范成，鄢长余，刘斯亮，等.HPLC法测定滑膜炎制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量[J].中国药物评价，2020，37（2）：111-114.

[14]蒙秋伊，付瑜华，申刚，等.薏苡种质资源中甘油三油酸酯和意苡素的测定[J].江苏农业科学，2019，47（1）：186-188.

[15]陈倩，李娜，何桂霞，等.HPLC法同时测定金樱子中7种多酚类成分[J].中药材，2018，41（2）：394-396.

[16]张晶，汤尘尘，方艳.HPLC法同时测定覆盆子中7个成分的含量[J].中国药师，2020，23（12）：2496-2499.

[17]贾富娟，崔露露，高德民，等.HPLC测定不同品种石韦中绿原酸、芒果苷、咖啡酸、芦丁含量[J].食品与药品，2017，19（3）：187-189.

[18]高森，白雪，文柳静，等.基于一测多评法桂芍镇痫片中8种成分定量质量控制研究[J].中草药，2018，49（12）：2883-2889.

[19]刘香叶，赵赛，朱月梅.一测多评法同时测定小儿止嗽金丹中6种成分含量[J].中国现代中药，2020，22（4）：622-627.

[20]冯子芳，袁晓航，费逸明，等.葆肾合剂HPLC指纹图谱研究[J].中国药师，2020，23（9）：1750-1754.

[21]秦昆明，杨冰，蔡宝昌，等.一测多评法在中药多组分质量控制中的应用现状与思考[J].中草药，2018，49（3）：725-731.