Sigma-1受体激动剂PRE-084对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

王 瑞，张玲叶，杜艳华

(广东省深圳市龙华区人民医院心内科，广东 深圳 518109)

急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)再灌注治疗后心肌的缺血再灌注损伤，不同程度抵销了灌注治疗作用[1-3]。Sigma-1受体(Sigma-1 receptor,Sig-1R)应用于心肌疾病患者中具显著保护心肌作用[4-5]。新型选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)如舍曲林、氟伏沙明具备很强的Sigma-1受体激动效果[6-7]。在改善抑郁症状的同时对心脏具备防护效果[8]，主要用于心血管疾病与抑郁的治疗。笔者前期研究提示PRE-084降低心肌缺血后灌注损所伤引起细胞调亡，其机制与激活Akt / eNOS信号通路有关[9]。本研究通过大鼠建立在体缺血后灌注损伤模型观察大鼠缺血再灌注损伤应用PRE-084对心肌梗死范及效果。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂

1.1.1实验动物 选用24只重量在220～250 g的SD雄性大鼠(动物合格证号：SCXK鄂2015-0018)由武汉大学动物实验中心提供为研究对象，其均为SPF级。

1.1.2试剂盒 试剂盒均为购自南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)测试试剂盒、丙二醛(monochrome display adapter，MDA)测试试剂盒、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测试试剂盒及肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)测定试剂盒。

1.2实验分组 将24只大鼠采用电脑进行随机分组，PRE-084组(8只)、假手术组(8只)以及缺血后灌注组(8只)，其中缺血后灌注组与假手术组术前输入生理盐水，PRE-084组输入同量的1 mg/kg PRE-084，假手术组不结扎只穿线。实验在武汉大学人民医院心血管211实验室完成。

1.3实验方法

1.3.1动物模型制作及样本获取 大鼠术前12 h禁食。简要操作方法为：将10%水合氯醛依据3 mL/kg的比例进行麻醉注射，在实验大鼠气管插管后，将其与动物呼吸机链接并设频率为60次/min，潮气量设置为50 g/mL，在胸骨左侧开，用细小弯针在冠状动脉左前降支中上1/3处穿线(6/0号)，穿双线(一根用于尹文思兰染色前结扎)。以肉眼可见结扎点的肉眼观察到远端心前壁变紫或苍白，结扎后进行心电图ST段变化情况的评估，将其中无变化者淘汰，于缺血30 min之后，松开结扎线，观察约10 min后逐层缝合，连续观测心电图30 min。

1.3.2大鼠心功能的监测 再灌注24 h后再次以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定四肢与头，双上肢和双下肢皮下依次链接针形心电图电极，观察并记录Ⅱ导联心电图情况。采用酒精对颈、胸部进行消毒后，剪除颈前缝线，轻轻分离颈前肌后可见气管，再次插管；将右侧颈部肌进行分离，暴露颈动脉后结扎远心端，近端用小动脉夹夹闭；在动脉上剪一“V”字形口，用聚乙烯导管插入切口，松开动脉夹，小心推送导管，使导管缓慢经过右侧颈总动脉最后进左心室，将血管与导管用线结扎，固定导管。压力换能器连接生物信号分析系统，记录心脏压力曲线。记录保存2 min的左心室压力曲线。根据压力曲线分析(Biopac system软件)左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、等容收缩期左心室内压力上升的最大速率(+dp/dtmax)及等容舒张期左心室压力下降的最大速率(-dp/dtmax)，心率(heart rate，HR)。

1.3.3CK-MB 心功能检测完成后分离一侧股静脉，先从股静脉取血1 mL用于查血清CK-MB。

1.3.4心肌梗死面积测定 取血完成后再次插管；接呼吸机。剪开胸壁，用前1 d预留的线再次结扎冠状动脉，从股静脉注入1%伊文思蓝2 mL, 可以让非缺血区心肌蓝染。然后取之心脏，冲洗后祛除心房心室，在-80 ℃冰箱冰冻20 min后取出，将其切成4～6块1.5 mm心肌片,其放在37 ℃的2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC溶液中15 min，将活的心肌组织染成砖红色。依次用滤纸将切片吸干水分后进行称重。双面彩色拍照。根据心肌厚片表面的3种颜色, 用Photoshop7.0和计算不规则多边形面积软件分别测定双面梗死区面积和缺血区面积占整片心肌切面的百分比。

1.4心肌SOD、MDA测定 心肌梗死面积测定完成后行留取缺血区心肌，采用冰生理盐水进行处理,并以滤纸吸干后进行称重, 低温匀浆离心,吸取上清测定MDA含量和 SOD活性 。

1.5统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据。计量资料比较采用t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PRE-084对缺血再灌注对大鼠血清CK-MB、SOD及MDA的影响的影响 再灌注结束后检测各组CK-MB，结果显示，I/R组、PRE-084组的CK-MB值和MDA值均高于Sham组，SOD值低于Sham组，PRE-084组的CK-MB值和MDA值均均低于I/R组，SOD值高于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 PRE-084对缺血再灌注大鼠CK-MB、SOD、MDA的影响Table 1 Effect of PRE-084 on CK-MB, SOD and MDA in ischemia-reperfusion rats

2.2PRE-084对血流动力学的影响 再灌注24 h后，与Sham组相比，PRE-084组及I/R组+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVSP明显下降,与I/R组相比，PRE-084组明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与Sham组相比，PRE-084组及I/R组LVEDP升高，差异有统计学意义(P<0.05)，I/R组和PRE-084组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 PRE-084对血流动力学的影响Table 2 Effects of PRE-084 on hemodynamics

2.3PRE-084对心肌梗死面积的影响 I/R组与PRE-084组缺血区占左心室面积分别为(0.45±0.08)mm2和 (0.45±0.09)mm2，差异无统计学意义(t=0.000，P=1.000)。两组的心肌梗死范围分别为(0.49±0.10)%和(0.35±0.09)%，两组比较差异无统计学意义(t=2.943，P=0.054)。

3 讨 论

急性心肌梗死病死率和致残率高，尽早进行心肌再灌注治疗可以降低病死率，改善患者心功能，是最佳治疗方案。然而部分患者的缺血心肌在恢复血液灌注后，因氧化应激等引起组织细胞损伤,可导致心肌梗死面积扩大情况的发生，且心功能呈现降低的趋势，并可出现再灌注性心律失常等异常情况。心肌缺血后灌注损伤降低了再灌注治疗作用。近年来心肌缺血/再灌注损伤的发生机制是临床研究的重点与热点之一。本前期研究提示Sigma-1受体激动剂PRE-084可通过激活Akt/eNOS信号通路降低心肌缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡，提示Sigma-1受体激动剂PRE-084可能具有降低心肌梗死面积，并有助于改善心功能，其机制除了降低细胞凋亡外，还可对氧自由基产生产生影响，显著提升其对氧自由基的清除能力。

缺血再灌注的前数分钟，能经过多种途径产生大量活性氧[10]。相关学者用同位素方法证实心肌缺血及其后的再灌注过程中有活性氧的形成[11]，之后临床研究发现抗氧自由基治疗具有心肌保护作用[12-13]。MDA是I/R损伤中自由基所诱导脂质过氧化反应产物之一[14]。其可导致细胞膜受损，出现细胞膜结构和功能等方面的损伤[15]。因此MDA对于体内脂质过氧化反应具有一定的反应作用，间接地反映细胞损伤的程度。本研究显示，PRE-084治疗组MDA下降，提示对心肌保护作用与降低氧自由其损伤有关。体内自由基的清除通过SOD实现，SOD是过氧化物酶，能够还原过氧化物，减少活性氧簇的生成。超氧化物可快速, 自发歧化为过氧化氢, 在SOD作用下这种转化可加速约1万倍，这种快速转换有效地防止了O2-与其他生物分子在细胞中的反应。本研究显示缺血后灌注使SOD显著下降，降低了氧自由基清除能力，而PRE-084治疗组SOD上升，提示PRE-084治疗增加机体对氧自由基的清除能力。

本研究提示再灌注24 h后，经PRE-084预处理，心肌梗死后心肌细胞膜受损时，可导致其细胞内释放，并进入血液中，因此其在血液中的表达水平有助于了解心肌的受损程度。同时，PRE-084治疗组心脏功能显著升高，提示PRE-084治疗降低心肌缺血再灌注心肌损伤。

综上所述，PRE-084预处理减少心肌梗死后心肌损伤作用机制可能与Sigma-1受体激动剂PRE-084可激活的Akt/eNOS信号通路降低心肌缺血再灌注损伤，及降低氧自由基损伤等有关。