高产蛋白酶和纤维素酶放线菌的筛选、鉴定及酶活测定

申术霞 孟庆伟 刘金玺 任彦慧

摘要：从含废弃物土壤中分离筛选出一株同时产蛋白酶和纤维素酶的放线菌，并对其产酶活力进行测定，采用形态学和分子生物学对筛选菌株进行菌种鉴定。结果表明，筛选出的高产蛋白酶和纤维素酶的菌株GT-B-S001为嗜热一氧化碳链霉菌，该菌株产蛋白酶活力为161.3U/毫升、产纤维素酶活力为135.5U/亳升。GT-B-S001有较强的产蛋白酶和纤维素酶的能力，具有较好的应用前景。

关键词：蛋白酶；纤维素酶；嗜热一氧化碳链霉菌；酶活力

近年来，伴随社会经济的发展和人口增长，人们对粮食数量和质量的高度追求，农业有机废弃物也随之大量产生。在大量生成的农业有机废弃物中，占首位的是农业秸秆，其次为畜禽粪便。这些都制约了农业生产的发展，恶化了人类与大自然的和谐关系，而解决这一问题的根本途径是开展农业有机废弃物的资源化利用。

农用微生物正适应了现代农业发展的需求，利用微生物对有机废弃物进行处理，来治理土壤污染、改善生态环境，使有益微生物菌群回归自然，维护好土壤、生态的健康。利用微生物对有机废弃物进行发酵，生产有机肥料又称“堆肥”。它是指在微生物的作用下，通过高温发酵使有机物得到分解、腐殖化和无害化的过程。在此过程中，会生成一些能被植物容易吸收利用的营养成分，同时合成一些能够提高土壤肥力的新的有机物。而堆肥的研究重点是寻找产蛋白酶和纤维素酶能力强的菌株（细菌、真菌、放线菌等）。本研究从土壤中分离筛选得到一株高产纤维素酶和蛋白酶的放线菌，为进一步研究提供理论依据。

1.1 样品

选择常年覆盖有农业有机废弃物的土壤，取样并将其装入灭菌后的采样袋中，-20℃保存备用。

1.2 培养基

蛋白酶筛选培养基：脱脂奶粉50.0克/升，琼脂粉20.0克/升，113℃灭菌15分钟。

纤维素酶筛选培养基：刚果红纤维素培养基。高氏一号培养基：可溶性淀粉20克/升，硝酸钾1克/升，磷酸氢二钾0.5克/升，硫酸镁0.5克/升，硫酸铁0.01克/升，氯化钠0.5克/升，p小时7.2～7.4。发酵培养基（g/ L）：羧甲基纤维素钠（CMC），磷酸二氢钾1.0克/升，氯化钠0.1克/升，7水硫酸镁0.3克/升，硝酸钠2.5克/升，氯化铁0.01克/升，氯化钙0.1克/升，蛋白胨10.0克/升，蔗糖10.0克/升，氯化钠5.0克/升，p小时 7.0～7.5。

1.3 产蛋白酶菌株的分离筛选

初筛：用无菌水对采集的样品进行梯度稀释，分别吸取200微升的10-3、10-4、10-4、10-6稀释液均匀涂布于高氏一号培养基中，28℃培养48小时，挑取生长均匀的单菌落进行纯化。挑取纯化后的单菌落接种于蛋白酶筛选培养基，28℃培养48小时，观察菌落周围透明圈大小，挑选透明圈与菌落直径比值较大的菌株为初筛菌株。

粗酶液的制备：初筛菌株接种于发酵培养基中，28℃、200转/分钟振荡培养96小时，得到的发酵液于12000转/分钟离心20分钟制备粗酶液，测定蛋白酶活力，选取酶活力较高的菌株为目标菌株。

1.4 蛋白酶活力的测定

采用Folin-酚法测定蛋白酶活力。将200微升粗酶液与200微升的2%酪蛋白溶液充分混匀，于40℃温度下反应10分钟后加入600微升的0.4摩尔/升的三氯乙酸终止反应，静置10分钟，12000转/分钟离心10分钟制备上清液。取100微升上述制备的上清液，依次加入500微升的0.4摩尔/升的碳酸钠溶液、100微升的福林酚试剂，充分混匀后于40℃温度下保温显色20分钟，在波长650纳米下测定其吸光度。先加入三氯乙酸以终止反应的一组作为对照组。酶活定义：在pH7.0、温度40℃的条件下，以每分钟水解2%酪蛋白溶液所产生1微克的酪氨酸酶量作为1个酶活力单位（U/毫升）。

1.5 产纤维素酶菌株的分离筛选

将上述筛选得到的高产蛋白酶的菌株，经无菌水进行梯度稀释后，涂布于刚果红纤维素培养基中进行筛选，于28℃恒温培养箱中培养，根据菌落形态选取挑选透明圈与菌落直径比值较大的菌株，接种于发酵培養基中，28℃、200转/分钟振荡培养96小时，得到的发酵液于12000转/分钟离心20分钟制备粗酶液，测定滤纸酶（FPA）活性，对菌株进行复筛。

1.6 纤维素降解菌产酶活力测定

取一定量的粗酶液，加入含有50 毫克的CMC（或滤纸）、且pH为4.4的缓冲液中，55℃ 保温1小时（或20分钟），之后再加入二硝基水杨酸（DNS），沸水保温显色10分钟后，冷却至室温，在波长550纳米下测其OD值。酶活定义：将每分钟产生1微摩的葡萄糖定义为一个酶活单位，用“U”表示。

1.7 高产蛋白酶和纤维素酶菌的鉴定

菌株形态鉴定：筛选得到的菌株GT-B-S001接种于高氏一号培养基平板中，28℃恒温培养96小时，观察菌落形态。挑取单菌落涂片、革兰氏染色后显微镜下观测其形态特征。分子鉴定：保存的菌株 GT-B-S001两支斜面，送农业农村部微生物产品质量监督检验测试中心进行鉴定。

2.1 产蛋白酶菌株的筛选

从土壤中筛选出多株能够产蛋白酶的菌株。通过比较水解圈直径与菌落直径的比值（R/r）和测定其蛋白酶活力，选择R/r值为16/9的菌株GTB-S001（图1）作为初筛菌株进行保存，经测定其蛋白酶活力为161.3U/毫升。

2.2 产纤维素酶菌株的筛选

将筛选所得高产蛋白酶菌株GT-B-S001在刚果红纤维素培养基上培养，如图2所示，菌落周围有透明圈出现，并且R/r值为13/8。经测定该菌株产纤维素酶活力为135.5 U/毫升。

2.3 菌株GT-B-S001的鉴定

形态鉴定：菌株G T -B-S001在高氏一号培养基中，菌落颜色从最初的白色到成熟的灰色，菌落边缘不光滑、微凸。革兰氏阳性菌，孢子丝呈现直线或柔曲状。初步判定为放线菌（图3、图4）。

分子鉴定：经鉴定，菌株GT-B-S001的16 sRNA序列与链霉菌（Streptomyces thermocarboxydus）同源性达99%，确定菌株GT-B-S001为嗜热一氧化碳链霉菌（图5）。

试验结果表明，筛选出的高产蛋白酶和纤维素酶的菌株GT-B-S001为嗜热一氧化碳链霉菌，该菌株产蛋白酶活力为161.3U/毫升、产纤维素酶活力为135.5U/毫升。GT-B-S001有较强的产蛋白酶和纤维素酶的能力，具有较好的应用前景。

作者简介：申术霞（1989-），女，硕士研究生，中级工程师，研发员。主要从事微生物发酵及代谢产物的研究。