萧县葡萄皮中可溶性膳食纤维的提取及其抗氧化性研究

王 晴，周 雪，钱玉梅，曹稳根

(1.宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000；2. 宿州市天然产物与功能性食品工程技术研究中心，安徽 宿州 234000)

萧县是我国四大葡萄种植区之一，位于苏鲁豫皖四省交界处，地处黄河故道，土地疏松，有良好的气候和土壤条件供葡萄生长，因此有“葡萄之乡”的美誉.萧县葡萄品种多达100种，为宿州萧县当地的经济发展提供了巨大的帮助，同时也顺应了特色产业扶贫的政治决策，但随着萧县葡萄种植业及其加工业的飞速发展，大量的葡萄废弃物随之产生.葡萄皮，是酿酒和葡萄汁等葡萄制品加工过程中大量产生的一种副产物，含量高达葡萄加工量的20%-30%.国内外研究数据表明，葡萄皮中含有多种生物活性物质，其中膳食纤维含量占葡萄皮的60%以上.如果能合理开发利用这部分资源，将带来巨大的经济效益.当前，国外对葡萄皮废弃物的应用比较广泛，但我国对葡萄皮中膳食纤维的研究尚浅，仍处于初级阶段，尤其在膳食纤维的制备、检验方法方面更是缺乏[1]，加工利用效率低，造成了大量资源的浪费.膳食纤维，是指食物中不被人体胃肠道消化酶所分解的、不可消化成分的总和，可作为人类食用的一种食品原料[2-3].作为第七大营养物质，膳食纤维具有治疗糖尿病、预防冠心病、降低血压、抗癌、治疗便秘、清除外源有害物质、降低血清胆固醇等多种功效[4].

本试验以萧县葡萄皮废弃物为试验原料，通过酶法对废弃葡萄皮可溶性膳食纤维进行提取，测定其中的果胶、纤维素、半纤维素、木质素的含量，对可溶性膳食纤维进行紫外光谱和红外光谱扫描，再进行理化性质(持水性、持油性)测定和抗氧化能力(还原能力、ABTS+清除能力)测定，旨在合理利用葡萄皮废弃物，为增加其附加价值提供参考.

1 试验用品

1.1 原料与试剂

赤霞珠葡萄皮(安徽省萧县萧城葡萄酒厂)；纤维素酶、无水乙醇、乙酸铵、甲醇、丙酮、醋酸、三氯乙酸、浓硫酸(上海国药集团化学试剂有限公司)；氢氧化钙、铁氰化钾、三氯化铁、过硫酸钾、ABTS+(上海阿拉丁生化科技股份有限公司).

1.2 仪器

可见分光光度计SP-723型(上海光谱仪器有限公司)；傅里叶变换红外光谱仪Nicolet IS50(赛默飞世尔科技公司)；紫外可见分光光度计HITACHI U-3900H(日本株式会社日立高新技术科学那珂事业所).

2 试验方法

2.1 原料预处理

从萧县萧城葡萄酒厂收集葡萄皮废弃物，洗净后于80 ℃下干燥24 h，粉碎，过80目筛，将得到的粉末进行密封，保存备用.

2.2 膳食纤维组分的测定

2.2.1 果胶的测定

称取干燥备用的葡萄皮粉末1.000 g，加入15 mL 0.5%乙酸铵溶液，于90 ℃下水浴加热1.5 h，冷却过滤.所得残渣用蒸馏水、甲醇、丙酮依次洗涤，烘干称重得A1.所得上清液加入4倍体积的无水乙醇，静置1 h.放入离心机中离心(6 000 r/min，20 min).离心后沉淀放置于75 ℃干燥箱中烘干，称重得果胶物质B.

2.2.2 半纤维素的测定

在室温下，向残渣A1中加入0.25%氢氧化钙溶液，物料浓度为3.3%， 50 ℃加热2 h.过滤，向残渣中依次加入蒸馏水、甲醇、丙酮洗涤.烘干称重得残渣A2.过滤所得碱性提取液用醋酸进行中和，加入4倍体积的无水乙醇，静置1 h后离心.离心所得沉淀经烘干称重得半纤维素B2.

2.2.3 木质素、纤维素的测定

向残渣A2中加入15 mL 50%的浓硫酸，于4 ℃冰箱里放置24 h.混合液经抽滤干燥，称重得A3.后置于马弗炉中燃烧灰分[6]，测得质量为A4.则木质素含量为A3-A4，纤维素含量为A2-A3-A4.

2.3 酶法提取可溶性膳食纤维

称取葡萄皮粉末 2.5 g，按料液比1∶20加入蒸馏水，超声波处理30 min (100 Hz)，向处理后的混合液中加入2.0%的纤维素酶，55 ℃加热3 h， 100 ℃灭酶处理10 min.灭酶后，将混合液放置于离心机中离心20 min，转速为8 000 r/min.离心所得残渣用蒸馏水洗涤至中性得不溶性膳食纤维(IDF).离心所得上清液加热蒸发至原溶液体积的1/3，加入4倍体积的无水乙醇，静置1 h.静置后8 000 r/min离心20 min.沉淀80℃烘干称重即得可溶性膳食纤维(SDF)[7].

2.4 葡萄皮中可溶性膳食纤维结构初步鉴定

2.4.1 葡萄皮可溶性膳食纤维紫外光谱分析

取干燥的SDF样品，配制浓度为2 mg/mL的SDF样品水溶液，以蒸馏水为参比，使用10 mm石英比色皿，在紫外可见分光光度计上于190-700 nm波长处进行扫描，观察紫外光谱特性.

2.4.2 葡萄皮可溶性膳食纤维傅里叶变换红外光谱分析

称取2 mg干燥的SDF样品，与适量KBr粉末充分混合，在洁净的玛瑙研钵中研磨成细粉并混合均匀.取研磨后的样品用压片机压成薄片，置于红外光谱仪中扫描，扫描范围4 000-400 cm-1，扫描次数32次，分辨率为8 cm-1[8].

2.5 葡萄皮中可溶性膳食纤维理化性质测定

2.5.1 葡萄皮可溶性膳食纤维的持水性测定

准确称取0.3 g SDF样品，加入5 mL蒸馏水震荡摇匀，于室温下静置12 h至溶液达到饱和状态.放入离心机中以4 000 r/min 离心20 min.除去上清液，用滤纸吸干残液，称取产品的湿重.

持水力(g/g)=
(产品湿重-样品干重)/样品干重.

2.5.2 葡萄皮可溶性膳食纤维的持油性测定

准确称取0.3 g SDF样品，加入10 mL植物油震荡摇匀，于4℃冰箱中，静置12 h.于离心机中以4 000 r/min离心处理20 min.除去上清液，并使用吸油纸吸去残液，称取样品湿重[9].

持油力(g/g)=
(样品被油饱和后湿重-样品干重)/样品干重.

2.6 葡萄皮中可溶性膳食纤维抗氧化性测定

2.6.1 铁氰化钾还原能力的测定

将提取的可溶性膳食纤维SDF溶于水中，分别配制成1-9 mg/mL浓度梯度的溶液.从不同浓度的溶液中各取1 mL样品溶液，分别向其中依次加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(PBS、pH=6.6)、2.5 mL 1%铁氰化钾.充分混合后，于恒温水浴锅中50 ℃下加热20 min.向其中加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，3000 r/min离心10 min.离心后吸取上清液2.5 mL，向其中加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液.充分混合，于700 nm处测定样品吸光值[10].

2.6.2 ABTS+清除能力的测定

将提取的可溶性膳食纤维SDF溶于水中，分别配制成1-10 mg/mL浓度梯度的溶液.与此同时，将7 mmol/L的ABTS+溶液与2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液等体积混合，充分混匀后在常温下避光反应12-16 h，反应结束用无水乙醇稀释，使用分光光度计在734 nm波长测定吸光值在0.70±0.02范围内[11].取不同浓度的葡萄皮渣SDF溶液0.1 mL，向其中加入2.9 mL的乙醇稀释液，混合均匀.继续避光反应20 min，在734 nm处测定不同浓度样品的吸光值，记为A样品.同时，用蒸馏水替代样品溶液，重复以上操作，测定吸光度值为A对照.

ABTS+清除率=(1-A样品/A对照)×100%

3 结果与分析

3.1 膳食纤维组分测定结果

膳食纤维组分测定结果如图1所示.由图1可知，各膳食纤维组分含量由大到小为：木质素>果胶>纤维素>半纤维素.其中木质素、纤维素、半纤维素为不溶性膳食纤维组分，果胶和部分半纤维素属于可溶性膳食纤维.据研究可知，不溶性膳食纤维吸收液体，在消化道膨胀，加快食物在消化道移动，但却不参加人体的血液和体液循环，不能被大肠中微生物酵解.此外，由于不溶性，使得不溶性膳食纤维在食品行业应用中受到了一定的限制，而可溶性膳食纤维溶于液体，参与人体的血液和体液循环，并能被大肠中微生物酵解，在循环过程中吸附和净化血液和身体各部器官，是维持健康血糖水平的有效工具，所以可溶性膳食纤维就更加弥足珍贵.通过酶法提取葡萄皮中可溶性膳食纤维，其含量为230.4±28.0 mg/g.

图1 可溶性膳食纤维各组分含量

3.2 可溶性膳食纤维结构初步鉴定

3.2.1 紫外光谱扫描结果分析

紫外可见吸收光谱又称电子跃迁光谱，吸收波长范围200-400 nm，可用于结构鉴定和定量分析.分子或离子吸收紫外或可见光后发生价电子的跃迁，同时又伴随振动和转动能级间的跃迁，因此紫外可见光谱呈现宽谱带.例如，多糖在200 nm处有特征吸收峰，核酸在260 nm处有特征吸收峰，蛋白质在280 nm处有吸收峰，某些色素在600 nm处有吸收峰[12].SDF的紫外光谱如图2所示，200 nm附近有最大吸收峰，此为多糖的特征吸收峰，表明SDF中含有大量糖类物质.200 nm以下出现的杂峰，可能是SDF样品溶液中溶解氧分子和水分子造成的杂峰.此外，在280 nm处有弱吸收峰，为蛋白质的特征吸收峰，是由于酶法提取SDF中残留的纤维素酶.

图2 SDF紫外光谱

3.2.2 红外光谱扫描结果分析

SDF的红外光谱扫描结果分析如图3.由图3可知，3 444 cm-1处出现的宽峰是O-H的伸缩振动，由于分子间和分子内氢键的形成，此处吸收峰较宽，2 800-3 200 cm-1处是糖类甲基上C-H的收缩振动，1 632 cm-1是羧基COO-的特征峰，该区吸收峰强度较大，说明样品中含有糖醛酸，1 200-1 400 cm-1区域的吸收峰是糖类的特征吸收峰，是由C-H的变角振动产生的， 1 107 cm-1是表征半纤维素的特征吸收峰，是C-O、C-C、的伸缩振动或是C-O-H的弯曲振动.由于半纤维素是由多种糖基糖醛酸基所组成的复合聚糖，结构不同，其溶解性能也不同[8].

图3 SDF红外光谱图

3.3 持水力和持油力测定结果分析

持水力是在外力作用下，SDF保持水分的能力，所以人体摄入膳食纤维会有饱腹感，从而达到减肥的作用.可溶性膳食纤维化学结构中含有很多亲水性基团，如果胶、部分半纤维素，因此具有较强的持水性；持油力的大小由SDF中亲脂基团的数量决定，持油力值越高，则SDF吸收食物中油脂能力越强，对人体肠道健康有益.本试验中SDF持水力和持油力大小如图4所示，测得持水力为1.25 g/g，持油力为0.67 g/g.

图4 SDF持水力、持油力测定

3.4 抗氧化性测定结果

3.4.1 铁氰化钾还原能力测定结果分析

还原剂是通过自身的还原作用，给出电子而清除自由基，还原能力越强，抗氧化性越强.由图5中数据可知，不同浓度SDF还原能力不同.随着SDF浓度的增加，吸光值不断增加，表示相应还原能力不断增强[13].SDF浓度为1-6 mg/mL时，还原能力增长趋势较明显，此后趋于平缓.

图5 SDF还原能力测定

3.4.2 ABTS+清除能力测定结果

ABTS+清除能力测定结果如图6.可以看出，在SDF浓度范围内，SDF与ABTS+清除能力呈正相关，当质量浓度超过9 mg/mL，ABTS+清除率有下降趋势，在本研究中，ABTS+清除自由基能力最高达到77.5%，说明可溶性膳食纤维具有较好的自由基清除能力.

图6 ABTS+清除能力测定曲线

4 结论

本试验测定了葡萄皮中膳食纤维的组分含量，并使用酶法提取可溶性膳食纤维，对其进行紫外和红外光谱扫描，研究其理化性质和抗氧化性.通过试验可得，葡萄皮中可溶性膳食纤维含量为230.4±28.0 mg/g，紫外和红外光谱扫描结果显示可溶性膳食纤维中含有大量糖类物质，并测得可溶性膳食纤维持水力为1.25 g/g，持油力为0.67 g/g.此外，不同浓度的SDF还原能力不同，随着SDF浓度的不断增加，还原能力不断增强，最初趋势较明显，逐渐趋于平缓.ABTS+清除能力方面，在SDF浓度范围(1-9 mg/mL)内，SDF与ABTS+清除能力呈正相关，当质量浓度超过9 mg/mL时，ABTS+清除率有下降趋势.在本研究中，ABTS+清除自由基的能力最高达到77.5%，说明可溶性膳食纤维对自由基有不错的清除能力.综上，表明可溶性膳食纤维SDF有很好的应用前景[14].