影响根尖牙乳头干细胞成骨和成牙本质方向分化的因素

马振寰 崔彩云 李言君

[摘要]根尖牙乳头干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的牙源性间充质干细胞，是牙根部成牙本质细胞的重要来源，在牙根部牙本质的发育中发挥重要作用，其在多种因素作用下能够向成骨和成牙本质方向分化，具有形成牙髓-牙本质复合体的能力。诱导根尖牙乳头干细胞成骨和成牙本质方向分化，尤其是促进根尖孔未闭合的年轻恒牙牙根继续发育，对于患牙保存具有重要意义。本研究从生物活性材料及支架、炎症微环境、物理化学因素和基因转染等方面回顾了影响根尖牙乳头干细胞成骨和成牙本质方向分化的诱导因素，其中细胞外基质材料、硅酸盐类生物活性材料和炎症微环境的相关研究对牙髓-牙本质复合体再生具有更显著的作用优势。

[关键词]根尖牙乳头干细胞;成牙本质细胞;成牙本质分化;成骨分化

[中图分类号] R781.3  [文献标识码] A   [文章编号]2095-0616（2022）08-0048-04

2006年Sonayama等首次分离根尖牙乳头细胞，命名为根尖牙乳头干细胞（stem cell from the  apical papilla， SCAP），这类细胞具有多向分化潜能，是牙根部成牙本质细胞的重要来源，在牙根部牙本质的发育中发挥重要作用[1]。牙根未完全发育的年轻患牙因牙髓和根尖周炎症造成牙根发育停滞，在实施根尖诱导成形术后，根尖周组织中的根尖牙乳头干细胞等能够作为干细胞来源促进牙根的延长和管腔的缩窄促进牙根发育。探寻促进根尖牙乳头干细胞成骨和成牙本质方向分化的理想诱导微环境，对实现再生牙髓-牙本质复合体用于治疗牙髓及根尖周病的年轻恒牙具有重要意义。

1生物活性材料

1.1 生长因子

生长因子是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质，近年研究主要涉及转化生长因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）、甲状旁腺激素（parathyroid hormone， PTH）和1，25-二羟基维生素 D3。TGF-β是一种具有多种生物学功能的细胞因子，1 ng/ml TGF-β2体外促进人 SCAP 牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein， DSPP）和牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1， DMP-1）表达，抑制骨涎蛋白（bone sialoprotein， BSP）表达， TGF-β2体外促进 SCAP 成牙本质方向分化[2]。PTH 促进人 SCAP 体外细胞增殖、骨钙素（osteocalcin， OCN）、骨桥蛋白（osteopontin， OPN）、osterix（OSX）、runt-related transcription  factor 2（RUNX2）、膠原蛋白Ⅰ型（collagen type Ⅰ， COL-I）、DSPP 基因和蛋白表达，促进 SCAP 成骨和成牙本质方向分化[3]。1，25-二羟基维生素 D3 是调节人体钙磷代谢的重要激素，也是细胞生长分化、免疫系统功能和中枢神经系统功能的关键调节因子，体外促进 SCAP 黏附、增殖和 Runx2、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、COL-I 和 OCN 表达，促进 SCAP 成骨方向分化[4]。

1.2 细胞外基质

细胞外基质富含多种细胞因子、生物活性蛋白等在促进 SCAP 成骨成牙本质方向分化中具有重要的作用。近年来的相关研究主要包括人血小板裂解物（human platelet lysate， HPL）、血小板衍生生长因子 BB（platelet derived growth factor， PDGFBB）、富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin， PRF）和浓缩生长因子（concentrate growth factors， CGF）。HPL 是一种来源于人血小板的无异种源、无动物血清的产物，含有细胞生长所需的所有生长因子和蛋白质，HPL 体外促进接种于 PLGA 支架的 SCAP 增殖、黏附和 ALP、OPN、OCN 表达[5]。 PDGFBB 体外促进 SCAP 的增殖， PDGFBB 水凝胶促进大鼠颅骨缺损模型中新骨的形成和矿化[6]。 PRF 含大量生长因子和细胞因子，CGF 是新一代血浆提取物，富含浓缩生长因子和纤维蛋白，在骨再生方面优于 PRF。PRF 条件培养液显著促进SCAP 体外迁移、ALP、DMP-1表达和矿化结节的形成， PRF 通过 ERK 信号通路促进 SCAP 成骨和成牙本质方向分化[7]。

1.3 无机生物活性材料

常用的生物活性材料为硅酸盐生物活性材料，如三氧化二矿物集合体（mineral trioxide aggregate， MTA）、BD（bio-dentin）、ProRoot、iRoot Fast Set  root repair material（iRoot FS）等。MTA 通过激活 p38和 ERK 信号通路促进 SCAP 向成骨方向分化[8]。IRoot FS 增强 SCAP 矿化能力，促进 DSPP、ALP 基因和蛋白表达，作用优于 MTA[9]。硅酸盐材料促进 SCAP 体外矿化、成骨和成牙本质方向分化[10-11]。这些硅酸盐材料体外诱导 SCAP 的矿化、成骨和成牙本质方向分化，从而促进其在再生性牙髓治疗中的应用。

目前，细胞因子、细胞外基质及其支架材料并未广泛应用于临床。大量研究表明 SCAP 体外有很强的成骨和成牙本质方向分化能力，但缺乏动物异位及临床原位再生的研究。TGF-β2具有抑制骨形成和促进成牙本质方向分化的能力，对于牙髓-牙本质复合体再生研究具有重要研究价值;血液来源的 HPL、PDGFBB、PRF 和 CGF 有良好的临床应用前景，需要大量实验研究提供临床应用基础;硅酸盐材料可刺激胶原、前列腺素等基因上调诱导细胞产生更多的矿化基质，其生物相容性及生物安全性在临床中被广泛认可，且已取得了良好的临床治疗效果，具有良好的应用前景，其作用机制有待进一步明确。

2炎癥微环境

由于炎症因子的表达及抗菌成分的不同， SCAP 在炎症微环境下的分化也会受到影响，目前研究的影响因素主要有脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）和抗菌肽等。LPS 是革兰阴性菌的主要成分，在成牙本质细胞、成纤维细胞、牙髓干细胞和 SCAP 中作为内毒素诱导多种免疫反应。0.1μg/ml LPS 促进 SCAPs 细胞增殖、ALP 活性、矿化结节形成和 DSPP、RUNX2、BSP 表达，通过 ERK 和 P38信号通路促进 SCAPs 成骨和成牙本质方向分化[12]。5 mg/ml LPS 可抑制 SCAP 细胞增殖、矿化结节形成和 DMP-1、RUNX-2和 ALP 的表达，5 mmol/L 的自噬抑制剂3-MA 逆转 LPS 引起的矿化结节形成和 DMP-1、RUNX-2和 ALP 的表达，证实细胞自噬在 LPS 诱导的炎症环境中参与 SCAP 成骨和成牙本质方向分化的抑制[13]，自噬调节可能作为一种新的策略，促进 SCAP 在炎症环境下的成骨和成牙本质方向分化。1μg/ml 和5μg/ml LPS 增强小于根发育期的1/2的 SAPC（ER-APC）矿化能力和 BSP 表达，但1μg/ml 对根发育期的1/2～3/4 SAPC（LR-APC）的矿化及 BSP 表达无影响能力无影响，5μg/ml 可以促进 LR-APC BSP 表达，对矿化无影响，不同浓度的 LPS 可对 SCAPs 产生不同的影响，相同浓度的 LPS 在 SCAPs 不同时期产生的影响有差异[14]。抗菌肽 LL-37除了具有广谱的抗菌功能，还能促进牙齿形成和成骨，2.5 mg/ml LL-37促进 SCAP 的 DSP、 DMP-1、RUNX2、OSX 表达，2.5 mg/ml LL-37通过激活 Akt/Wnt/β-catenin 信号通路促进 SCAPs 迁移和成骨和成牙本质方向分化[15]。综上所述， SCAP 在体外模拟的炎性环境下受到影响与受到 LPS 浓度及作用时间有明显相关性，研究多为细胞学实验未见动物实验及临床报道。细胞代谢产物及抗菌成分与 SCAP 存在复杂的相互作用，探索如何控制炎症减轻或消除其对 SCAP 成骨和成牙本质方向分化的抑制作用具有重要意义。

3其他因素

3.1 物理因素

影响根尖牙乳头细胞分化的物理因素包括环境微刚度、支架弹性模量、光照等。SCAP 通过改变其细胞形态和细胞骨架来响应不同的底物硬度纤维连接蛋白与黏着斑块中的黏着斑激酶（FAK）和帕西林相互作用，并且 FAK 和帕西林的表达随着底物硬度的增加而增强[16]。多孔丝素支架的弹性模量（elastic modulus of porous silk fibroin  scaffolds）基质的物理性质（弹性模量）将成为干细胞分化为不同谱系的重要因素，SCAP 对海绵基质模量在16～131 kPa 范围内表现出成骨敏感性， OPN、RUNX2、OCN 表达上调，多孔支架的成骨能力随弹性模量的增加而增强，模量为83 kPa 的支架成骨能力最强[17]。低能量蓝光照射促进 SCAP 的成骨分化，上调 ALP、DSPP、DMP-1和 OCN 的表达水平[18]。200 g 机械牵张力能促进 SCAP 成牙本质方向分化，提高 ALP、OSX、DSP mRNA 及蛋白的表达水平[19]。

3.2 化学因素

影响根尖牙乳头细胞分化的化学药物主要包括氟化钠、信号通路抑制剂等。0.5 mM NaF促进 SCAP 矿化结节形成和 RUNX2、OSX、DSP、OCN 表达[20]。100 mg/L 乙酰水杨酸诱导 SCAP 后联合 PI3K-AKT 信号通路抑制剂 LY294402可以促进矿化结节形成，促进 SCAP 成牙本质方向分化[21]。毛喉素（Forskolin）和 TGF-β1抑制剂共处理可提高 SCAP 的 ALP 活性和钙矿物的沉积[22]。

3.3基因转染相关因子

基因转染技术是将纯化的含靶基因的质粒DNA转移至细胞内，使其在细胞内表达并发挥一定的功能。近年的研究主要集中在cAMP反应元件结合蛋白123、微核糖核酸hsa-let-7（ MicroRNAhsa-let-7 ）24-25]、分泌型卷曲相关蛋白2（ secretedfrizzled-related protein 2，SFRP2 ）[26l、无远端同源盒5 （distal-less homeobox 5，DLX5 ） 127。这部分研究结果为SCAP成骨和成牙本质方向分化的功能调控机制提供实验基础，是作用机制研究的常用手段依据，但动物实验及临床应用受到局限。

4总结与展望

综上所述，诱导根尖牙乳头干细胞成骨和成牙本质方向分化的影响因素主要包括生物活性材料及支架、炎症微环境、物理化学因素和基因转染等。上述研究中使用的细胞主要来源于鼠和人，可以根据获取的难易程度以及实验需求选择组织来源;体外研究中主要通过ALP染色、Realtime-PCR、Western blot等方法定量检测相关指标表达量的高低来确定细胞成骨和成牙本质方向分化;SCAP成骨和成牙本质方向分化过程复杂、涉及Akt、Wnt和NF- xB等多条信号通路。目前尚未有文献报道明确某一指标升高或降低高即根尖牙乳头干细胞发生成骨方向分化或成牙本质方向分化。无免疫源性的血液来源细胞外基质材料、硅酸盐类生物活性材料或两者材料的混合，炎症微环境的相关研究有望成为牙髓-牙本质复合体再生临床转化应用的理想诱导微环境。

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（收稿日期：2021-11-15）