应用ISSR 和SRAP 标记构建李遗传连锁图谱

孙莉莉，彭丽娜，李 铮，侯睿宁，牟蕴慧

（1.黑龙江省农业科学院园艺分院，黑龙江 哈尔滨 150069；2.哈尔滨体育学院运动人体科学学院，黑龙江 哈尔滨 150008）

【研究意义】李（Prunus salicinaL.）属蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）植物，李属分类复杂且较难区分，世界上共有30～40 种［1］，国际上将李亚属分为杏组（Sect.Armeniaca）、真李组（Sect.Euprunus）和樱李组（Sect.Prunocerasus）［2］。真李组包括中国李（Prunus salicinaLindl.）、杏李（Prunus simoniiCarr.）、乌苏里李（Prunus ussuriensisKov.&kost.）、欧洲李（Prunus domesticaL.）、樱桃李（Prunus cerasiferaEhrh.）及黑刺李（Prunus spinosaL.）等6 种，其中商品李为二倍体的中国李（又称日本李）和六倍体的欧洲李［3］。我国李属植物分布广、适应性强，在浙江、福建、广东、云南、四川、陕西、东北等地均有驯化栽培的品种［3］，其资源种类及数量均居世界第1 位［4］。黑龙江省位于我国最北区域，李的抗寒种质资源丰富，与其他作物相比，李的经济效益比较显著［5］。由于优质、大果、耐贮运材料稀少，加之传统育种方法耗时长、成效低，亟需借助分子生物学手段加快育种进程。高质量遗传图谱的构建是分子标记辅助育种的基础。【前人研究进展】随着分子生物学的快速发展，DNA分子标记技术已经成为一种重要研究方法广泛应用于分子鉴定［6］、杂交种纯度分子检测［7］、种质资源多样性［8-9］、分子遗传图谱构建［10］、遗传多样性分析［11-13］及指纹图谱构建［14-15］等多个领域。DNA 分子标记是遗传图谱构建的主要手段，孙文英等［16］利用AFLP分子标记技术构建梨（PyrusL.）的遗传连锁图谱。艾小艳等［17］概述了构建桃（Prunus persicaL.）遗传图谱的多种分子标记方法，包括基于第一、第二代分子标记的RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）、SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性）和RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机引物扩增多态性DNA）技术以及基于第三代分子标记的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）技术。另外，Linge 等［18］也利用SNP技术构建桃的高密度遗传图谱。章秋平等［19］利 用SSR 和SRAP（Sequence-related Amplified Polymorphism，相关序列扩增多态性）标记构建了两张杏（Prunus armeniacaL.）遗传连锁图谱。Dang 等［20］通过SRAP、AFLP 和ISSR（Inter-simple Sequence Repeat，内部简单重复序列）标记构建芒果（Mangifera indicaL.）遗传连锁图谱。由此可见，通过分子标记技术构建遗传连锁图谱是切实可行的方法之一。分子遗传连锁图谱主要用于性状定位、分子标记辅助育种及功能基因克隆研究等，同时在遗传学、遗传分子育种及功能基因组学等方面发挥重要作用［21-23］。此外，对于遗传背景复杂的木本植物而言，“双假测交”理论的提出为多年生果树遗传图谱的研究提供了理论依据［24］。【本研究切入点】目前，国内外有关李的研究主要集中在种质资源调查［3］、遗传多样性［25-26］、果实性状分析［27］等方面，而关于李遗传连锁图谱构建方面的研究鲜见报道［28］。东北地区独特的地理环境和丰富的李种质资源，有利于开展优质、抗寒新品种的选育工作。如前所述，分子标记辅助育种技术可以加快育种进程，而遗传连锁图谱又是分子辅助育种的基础。【拟解决的关键问题】本研究以东北地区品种吉林6 号和龙园秋李作为亲本，以其F1后代作为作图群体，通过ISSR 和SRAP 分子标记构建李的遗传连锁图谱，为后续李的分子辅助育种提供理论依据，推进优质、抗寒李品种的选育。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来源于黑龙江省农业科学院园艺分院，以吉林6 号和龙园秋李为亲本材料，其中母本为吉林6 号，树势矮小，果实较小，平均单果质量40 g，果实成熟时为红色，离核，8 月中旬果实成熟；父本为龙园秋李（九三杏梅×台湾李），抗寒、丰产、树姿直立，耐红点病；果实扁圆形，平均单果质量75 g，最大果质量110 g；成熟时全面紫红色，半离核，较耐贮运，9 月初果实成熟，是北方寒地果实最大品种。

以F1子代实生苗为作图群体，选取80 个F1子代进行样本采集。杂交群体于2009 年杂交，2010 年播种，2012 年定植于黑龙江省农业科学院园艺分院核果试验园，长势较好，稀有开花结果，没有进行剔选。同时对F1子代进行连续两年的数据调查，调查内容包括部分生长性状和果实性状，其中叶片长、宽和果实横径、纵径经数据分析呈正态分布（数据未显示），用于QTL 定位分析。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取 分别采集吉林6 号和龙园秋李亲本及F1子代植株的幼嫩叶片，于-80℃冰箱中保存备用。根据天根植物DNA 提取试剂盒（DP305）的相关步骤进行DNA 的提取，提取后采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行DNA 质量的检测，电泳缓冲液为1×TAE，观察并拍照，用于后续引物筛选及遗传图谱的构建。

1.2.2 F1子代真实性鉴定 根据本课题组前期工作积累，选取特异性条带清晰的SSR 引物UDP96-005（F′GTAACGCTCGCTACCACAAA、R′CCTGCATATCACCACCCAG）来鉴定子代的真实性，比较F1群体与双亲的基因型，去除后代中与双亲基因型不一致的植株。

1.2.3 ISSR 及SRAP 引物筛选 试验所用的ISSR引物从UBC800-UBC900 中随机选取44 条，SRAP引物采用已公布的引物序列［29］，由me1-me10 及em1-em20 组合成200 对引物进行筛选，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

对亲本材料和2 个杂交后代基因组DNA 进行ISSR 和SRAP 引物筛选，试验选取PCR 扩增条带清晰、重复性好且多态性较丰富的14 条ISSR 引物（表1）和16 对SRAP 引物（表2）用于后续研究。

表1 ISSR 引物序列Table 1 Sequences of ISSR primers

表2 SRAP 引物序列Table 2 Sequences of SRAP primers

1.2.4 PCR 扩增 ISSR-PCR 反应体系为20 μL：10 × PCR Buffer 2 μL，引物（50 pmol/μL）2 μL，dNTP （each 10 mmol/L）0.4 μL，模板（DNA）1 μL，TaqPlus DNA Polymerase（2 U/μL）0.5 μL，加ddH2O 14.1 μL。PCR 反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，52～62℃退火1 min，72℃延伸2 min，40 个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶，1×TAE，150 V，100 mA，30 min 电泳观察。

SRAP-PCR 反应体系为15 μL：TaqPCR Master Mix，7.5 μL，正向引物（50 pmol/μL）1 μL，反向引物（50 pmol/μL）1 μL，模板（DNA）1μL，加ddH2O 4.5 μL。PCR 反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5 个循环；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30 个循环；72℃延伸8 min；4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶，1×TAE，150 V，100 mA，30 min 电泳观察。

1.3 数据分析

根据Join Map 4.0 软件中CP 作图模型（hk×hk、nn×np、lm×ll、ef×eg、ab×cd 等5 种分离类型）的要求，将PCR 所得凝胶结果在Excel 中按照模型要求进行数据录入，将作图群体个体数和每个个体的基因型横向录入，将引物位点名称和分离类型纵向录入，其中hk×hk（双亲均为杂合的基因型，h对k 为显性）、nn×np（母本为纯隐性基因型nn、父本为杂合基因型np，p 对n 为显性）、lm×ll（母本为杂合基因型lm、父本为纯隐性基因型ll，m 对l 为显性），选用LOD 值为0.5～10.0 的连锁群，采用Kosambi 函数计算图谱距离。本试验引物编号为引物名+条带分子量，用于构建李遗传图谱。

2 结果与分析

2.1 DNA 提取

采用植物DNA 提取试剂盒，分别对2 个亲本及80 个F1子代进行DNA 提取，提取后采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量。部分电泳结果见图1，图1 显示基因组DNA 条带完整无降解。

图1 F1 后代DNA 电泳结果Fig.1 Electrophoresis result of DNA from F1 progenies

2.2 F1 子代真实性鉴定

根据双亲基因型和子代群体的基因型，挑选出与双亲基因型不符的子代，通过筛选有72 个个体为真实性子代，用于后期群体验证。F1子代真实性部分鉴定结果见图2，根据亲本条带分布对子代条带进行对比分析，如图2 子代2 和子代10箭头所示，出现亲本中没有的条带，被鉴定为非真实性子代，排除群体之外。

图2 部分F1 子代真实性鉴定结果Fig.2 Authenticity identification results of some F1 progenies

2.3 分子标记的多态性分析

首先将44 条ISSR 引物、200 对SRAP 引物在亲本和2 个真实性后代中进行多态性筛选，根据PCR 凝胶结果分析得知，44 条ISSR 引物中有14 条引物条带稳定且清晰，引物比例为31.8%，ISSR 和SRAP 获得的标记数量如表3 所示，ISSR 引物产生等位基因数为74 个，每条引物均产5.3 个；200 对SRAP 引物中有16 对具有多态性，引物比例为8.0%，SRAP 引物产生等位基因数为46 个，每对引物均产2.9 个。本研究将筛选出的14 条ISSR 引物和16 对SRAP 引物进行亲本和72 个F1后代的PCR 扩增，以构建遗传图谱。引物在F1群体中产生标记位点120 个，经χ2检验后，偏分离位点有9 个，频率为7.5%。

表3 ISSR 和SRAP 标记的数量和分离类型Table 3 Number and segregation patterns of ISSR and SRAP markers

2.4 标记分离分析

利用ISSR 和SRAP 分子标记对李F1后代进行亲本和群体检测，发现多态性标记在作图群体中有不同的分离类型，根据Join Map 4.0 软件中的CP 作图模型，将亲本及F1后代的基因型划分为hk×hk、nn×np、lm×ll、ef×eg 和ab×cd 等5 种类型，每种分离类型在ISSR 和SRAP 标记中的数量如表3 所示，nn×np 类型总数相对较高。hk×hk型分离比例为1 ∶2 ∶1（图3A），nn×np 型（图3B）、lm×ll 型（图3C）分离比例为1 ∶1，ef×eg 型如图3D 所示，ab×cd 型如图3E 所示。

图3 ISSR 及SRAP 引物检测到亲本和F1 后代中的杂合位点分离类型Fig.3 Segregation pattern of heterozygous loci in parents and F1 progenies detected by ISSR and SRAP primers

2.5 分子遗传连锁图谱的构建

将获得数据导入Join Map 4.0 软件的CP 模型中，将LOD=5.0 设置为标记连锁群，同时将偏分离的9 个标记去掉，对120 个标记位点进行分析，成功构建了李遗传连锁图谱，该图谱包含38 个标记，其中ISSR 标记31 个、SRAP 标记7个，分布在16 个遗传连锁群内，如图4 所示。该遗传图谱在李基因组中覆盖528.5 cM，标记间平均图距13.9 cM，连锁群LG1 最长（71.1 cM），LG4 最短（9.6 cM）。分布在连锁群上的标记数最多为4 个，最少为2 个。多态性标记间最大遗传距离为52.8 cM，位于LG5 的ISSR842-2250 与me1em20-700 之间；最小遗传距离为1.4 cM，位于LG4 的ISSR880-500 与ISSR880-600 之间。

图4 李遗传连锁图谱Fig.4 Genetic linkage map of Prunus salicina L.

3 讨论

遗传研究和分子育种方法需要基本的基因组资源，如分子标记和连锁图谱。为开发李遗传研究资源，本研究利用分子标记方法构建李遗传连锁图谱。李为多年生木本植物，遗传背景复杂，且为异花授粉植物，很难获得自交群体［30］，而“双假测交”理论可以很好地解决这一难题，为李的遗传图谱构建和分子辅助育种提供了理论依据。同时，对遗传图谱构建来说，用于作图的亲本和群体选择尤为重要，遗传图谱作图亲本的选择应以遗传背景差异较大、亲缘关系较远为好。本研究选择吉林6 号和龙园秋李为作图亲本，依据前期遗传多样性分析结果显示，两者亲缘关系较远［31］，符合遗传图谱亲本选择的要求。另外，关于作图群体数量的阐述，章秋平等［23］研究表明，核果类果树遗传图谱群体大小范围为48～297株子代不等，本研究通过F1子代真实性鉴定，72株植株为真实性子代，群体数量适宜进行遗传图谱构建的研究。

分子标记方法具有引物通用性好、操作简单易行、多态性好且分布均匀等优点，被广泛应用于许多林木的遗传连锁图谱构建中［32-33］。本研究利用ISSR 和SRAP 分子标记，通过多态性筛选选出14 条ISSR 引物和16 对SRAP 引物来构建李的遗传连锁图谱。通过查阅文献得知，关于分子标记引物个数和标记方法的选择，不同研究存在较大差异。战晴晴等［34］利用28 条ISSR 和14 对SSR 多态性引物构建了北柴胡（Bupleurum chinenseDC.）遗传连锁图谱，包含72 个ISSR 和8 个SSR 位点；王晓敏等［35］利用14 对SRAP 引物组合、9 条ISSR 引物及10 对TRAP 引物构建了金针菇（Flammulina f iliformis）分子遗传连锁图谱，获得185个标记位点，其中SRAP 标记76个、ISSR 标记33 个、TRAP 标记74 个、不亲和性因子位点2 个。本研究中，共产生120 个清晰稳定的标记位点，其中ISSR 标记 74 个、SRAP 标记46 个，最终有38 个标记，其中31 个ISSR 标记和7 个SRAP 标记。由此可见，不同标记的组合选择可以最大程度地覆盖基因组，有利于增加图谱密度和提高图谱质量。

有研究表明，李是一种自交不亲和的二倍体种（2n=2X=16）［36］，Juan 等［37］对日本李进行SNP 连锁分析，获得8 个连锁群，同时将不同性状进行QTL 定位，其中果实成熟时间定位在LG4上，果皮颜色定位在LG3 和LG4 上。Basilio 等［38］利用GBS（Gnotyping-by-Sequencing）方法获得日本李高质量SNP 标记1 441 个，分布在8 个连锁群内。本研究获得的连锁群数为16 个，与上述研究结果不一致，可能原因是本研究采用的分子标记方法较少，获得的标记数较少，在基因组中分布较分散导致的，可以通过增加后代和分子标记的数量来缩小差距、提高连锁图谱的密度和分辨率。本研究结果丰富了李遗传连锁图谱的分子标记类型和标记位点，能更好地为李的基因定位和分子遗传育种提供理论依据。

4 结论

本研究构建了李遗传连锁图谱，以东北地区吉林6 号和龙园秋李为作图亲本，利用SSR 分子标记方法筛选出72 个真实性子代。分别利用14条ISSR 引物获得74 个等位基因，16 对SRAP 引物产生46 个等位基因。对PCR 扩增结果进行条带分析，获得亲本及F1后代的5 种基因型，分别是hk×hk、nn×np、lm×ll、ef×eg 和ab×cd，其中nn×np 类型数目相对较高。引物在F1群体中产生标记位点120 个，经χ2检验后，偏分离频率为7.5%，利用Join Map 4.0 软件的CP 作图模型进行Kosambi 函数计算，构建含有16 个连锁群的连锁图谱，包含38 个分子标记位点，覆盖基因组长度为528.5 cM。李遗传连锁图谱的成功构建可以推进东北地区李优质、抗寒新品种的选育和生产实践。