MicroRNA-183对急性主动脉夹层细胞外基质重塑的作用及其机制研究*

韦耀东，袁敏，魏梦瑶，刘岳恒，于洋，蒋璇，赵晔，师恩祎，谷天祥

（中国医科大学附属第一医院心脏外科，辽宁沈阳 110000）

急性主动脉夹层（acute aortic dissection, AAD）是一种急性心血管疾病，发病机制与主动脉中膜细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的降解有关。有研究报道， 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）通过调节ECM 重塑，参与胸主动脉瘤或胸主动脉夹层的发病，其中MMP-9作为MMPs 家族的一员，具有很强的降解弹性蛋白和胶原蛋白的能力，可导致主动脉中层的弹性蛋白和胶原蛋白大量崩解，诱导平滑肌细胞凋亡，从而促进主动脉夹层的形成[1-2]。 MicroRNA（miRNAs）的异常表达与多种心血管疾病的发展、发展有关[3]，引起人们广泛关注。在肿瘤中，细胞的增殖、侵袭、转移与MMP-9 在ECM 重塑和蛋白水解中的作用密不可分[4]，而miR-183 能够通过靶向调控MMP-9 的表达，抑制细胞的增殖、侵袭、转移[5-6]。目前miR-183 在AAD 中的表达及作用机制尚不清楚，本研究旨在探讨miR-183 和MMP-9在AAD 中的表达及其作用机制，以及其参与调节平滑肌细胞ECM 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2017年8月—2018年8月在中国医科大学附属第一医院就诊的AAD 患者。纳入标准：①经影像学诊断为AAD；②签字接受主动脉手术治疗的患者；③临床资料完整。排除标准：①马方综合征；②大动脉炎；③梅毒性主动脉夹层；④主动脉粥样硬化。根据纳入和排除标准，共纳入20 例AAD 患者作为AAD 组，其中男性14 例，女性6 例；年龄32～69 岁，平均（52.2±10.6）岁；选取20 例同期本院无主动脉病变的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者为NC 组，其中男性12 例，女性8 例；年龄33～65 岁，平均（54.8±9.0）岁。AAD 组标本取自升主动脉段破口周围的组织，NC 组标本取自在升主动脉处打孔的废弃组织，组织离体后，立即置于液氮中速冻，置入-80℃冰箱冷冻保存备检。本研究经医院医学伦理委员会批准（No：AF-SOP-07-1.1-01）。

1.2 主要试剂与仪器

人主动脉平滑肌细胞（HASMC）（美国ATCC 公司），引物、miRNA-183 mimic、miRNA-183 inhibitor 及RNAifectin™Transfection Reagent（加拿大ABM 公司），RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗人MMP-9、Elastin 抗体（英国Abcom 公司）。ABI 7500 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）仪（美国ABI 公司）。

1.3 HASMC细胞培养与转染

将细胞快速解冻复苏，培养于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基中，置于37%、5%二氧化碳培养箱中。取增殖状态良好的细胞进行消化、离心、计数，按1×105个/孔的密度种植于6 孔板中，待细胞融合达70%～80%，按照RNAifectin™Transfection Reagent 说明书实验步骤用miRNA-183 mimic、miRNA-183 inhibitor 对HASMC 进行转染，分别作为Mimic 组、Inhibitor 组，同时设置空白作为对照组，每组至少3孔。转染后置于培养箱内6 h，更换培养基后继续培养48 h，收集细胞用于下一步实验。

1.4 qRT-PCR 检测miRNA-183、MMP-9 mRNA的表达

采用TRIzol 法提取组织及细胞中总RNA，检测RNA 浓度及纯度，按照说明书进行逆转录，按比例加入Master Mix、正反向引物、RNAase-free 水，共20 μL，在qRT-PCR 仪上反应，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s、60℃退火34 s，共40 个循环，采用2-ΔΔCt法计算组织miRNA-183 相对表达量，以及细胞miRNA-183、MMP-9 mRNA 相对表达量。引物序列由加拿大ABM 公司提供，具体序列未告知。

1.5 Western blotting检测MMP-9、Elastin蛋白的表达

使用RIPA 裂解液提取组织和细胞中总蛋白，采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，配制SDS-PAGE 凝胶，每个孔道加入等量蛋白，电泳分离，标准湿式转膜，用PVDF 膜封闭于含5%脱脂牛奶中，水平摇床上室温封闭1.5～2.0 h，一抗4℃孵育过夜（MMP-9 稀释比例1∶3 000，Elastin 稀释比例1∶300），二抗室温孵育2 h，使用ECL 发光液在暗室中发光显色。Image J 分析条带灰度值，以GAPDH 为内参，以各目的蛋白与内参蛋白的比值作为组织中MMP-9 蛋白，以及细胞中MMP-9、Elastin 蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析；进一步两两比较用LSD-t检验；计数资料以构成比（%）表示，比较用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

AAD 组与NC 组年龄、性别构成比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 两组一般资料比较 （n=20）

2.2 两组miRNA-183、MMP-9 蛋白相对表达量比较

两组miRNA-183、MMP-9 蛋白相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），AAD组miRNA-183 相对表达量低于NC 组，而MMP-9 蛋白相对表达量高于NC 组。见表2和图1。

表2 两组miRNA-183、MMP-9蛋白相对表达量比较（n=20，±s）

表2 两组miRNA-183、MMP-9蛋白相对表达量比较（n=20，±s）

组别AAD组NC组t 值P 值miRNA-183 0.55±0.21 1.01±0.15-5.668 0.000 MMP-9蛋白0.97±0.04 0.64±0.13 4.728 0.013

图1 各组MMP-9蛋白的表达

2.3 转染后各组miRNA-183、MMP-9 mRNA 和蛋白、Elastin相对表达量比较

对细胞进行转染后，Mimic 组、Inhibitor 组、对照组miRNA-183、MMP-9 mRNA 和蛋白、Elastin 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与对照组比较，Mimic组miRNA-183、Elastin 蛋白相对表达量升高（P＜0.05），MMP-9 mRNA 和蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；Inhibitor 组miRNA-183、Elastin 相对表达量降低（P＜0.05），MMP-9 mRNA 和蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。见表3和图2。

表3 转染后各组miRNA-183、MMP-9 mRNA和蛋白、Elastin相对表达量比较 （±s）

表3 转染后各组miRNA-183、MMP-9 mRNA和蛋白、Elastin相对表达量比较 （±s）

组别miRNA-183 Elastin蛋白Mimic组Inhibitor组对照组F 值P 值1.59±0.19 0.82±0.15 1.01±0.07 33.649 0.000 MMP-9 mRNA 0.62±0.15 1.53±0.17 1.01±0.13 49.109 0.000 MMP-9蛋白0.32±0.03 1.19±0.1 0.69±0.02 139.958 0.000 1.22±0.11 0.31±0.06 0.79±0.04 110.194 0.000

图2 过表达或抑制miR-183对MMP-9、Elastin蛋白表达的影响

3 讨论

AAD 是一种严重威胁人类生命的心血管疾病，病情危急凶险，发病急骤、进展迅速、病死率高，每年发病率为4/10 万～7/10 万，且逐年上升[7-8]。据文献报道，未经治疗的Stanford A 型AAD 患者发病早期的病死率高达l%～2%/h，48 h 内的病死率约为50%[9]。近20年来，随着影像学诊断技术、外科治疗技术和血管内治疗技术的进步，A 型AAD 患者的总病死率有所下降，且A 型和B 型AAD 患者的手术病死率显著下降[10]。目前对AAD 的早期诊断、鉴别诊断、风险分层及预后评估都有其局限性。因此，积极探索AAD 的发病机制，对预测高发人群，寻找干预治疗靶点具有重要价值。

散发性AAD 的病理特征包括ECM 的改变和平滑肌细胞的丢失[11-12]，其中ECM 的改变主要是胶原蛋白和弹性蛋白大量降解及表达下调[13]。MMPs 是一种锌依赖性内源性蛋白酶家族，在ECM 成分蛋白的重塑和降解中发挥多种作用。大多数蛋白水解酶无法降解胶原蛋白和弹性蛋白，而MMPs 对胶原蛋白和弹性蛋白具有极强的降解能力[14]。MMP-9 是一种Ⅳ型胶原蛋白酶，能够降解多种胶原蛋白，对弹性蛋白同样具有很强的降解能力[15]。有研究表明，在胸主动脉夹层患者的主动脉壁中，MMP-9 蛋白主要定位于组织病变严重的区域[16]，这与其降解胶原蛋白和弹性蛋白的能力有关。本研究结果表明，MMP-9 蛋白明显高表达，且体外实验中，Elastin 随着MMP-9 表达增加或减少而呈现相反趋势，这表明在平滑肌细胞中，MMP-9 能够促进弹性蛋白水解，参与ECM 重塑过程。

miRNAs 是由19～25 个核苷酸组成的小分子单链非编码RNA，具有高度保守性，以碱基互补配对的方式与靶基因mRNAs 的3＇-非编码区特异性结合，转录后调控靶基因表达，参与大多数生物过程[17]。AAD 的发生、发展与miRNAs 的异常表达有关[18]。miR-183 在不同的生物中高度保守，其表达具有组织特异性。有研究报道，神经胶质瘤中miR-183 通过靶向IDH2，促进低氧诱导转录因子的表达，进而促进缺氧组织的血管生成[19]，miR-183 可通过上调IRS1 的表达，增强人脐带血管内皮细胞活性，抑制炎症水平，抵抗细胞损伤[20]。本研究发现，miR-183 在AAD 患者主动脉组织中明显低表达，表明miR-183 在血管的病理生理过程中发挥了作用。为进一步探讨miR-183 在AAD 中可能的分子机制，本研究用miR-183 模拟物和抑制物对HASMC 进行转染，结果发现miR-183 与MMP-9 存在负性关系，因此笔者推测miR-183 可能是通过调控MMP-9 在AAD 患者体内发挥生物作用。

综上所述，miR-183 在AAD 患者主动脉组织中低表达，MMP-9 蛋白则高表达，上调或下调miR-183 的表达能够在mRNA 和蛋白水平上影响MMP-9的表达，从而改变Elastin 的表达水平。miRNA-183调控平滑肌细胞中MMP-9 的表达，参与主动脉中膜ECM 重塑过程，为AAD 发病机制的研究提供新思路。