网状内皮组织增生病病毒、鸡贫血病毒、大肠杆菌混合感染诱导肉鸡腺胃炎

杜建才 ， 王桂花 ， 杨 洁 ， 张贤文 ， 魏宝国 ， 孙玉凤 ， 成子强

(山东农业大学动物医学院 ， 山东 泰安 271018)

山东某养鸡场规模为4万只商品肉鸡，在11日龄开始发病，发病率为40%，病鸡生长停滞，消瘦，粪便刺鼻，消化不良，精神不佳，羽毛蓬松。剖检表现为腺胃高度肿胀，腺胃乳头消失，腺胃糜烂。经了解病鸡在1日龄注射新城疫疫苗、禽流感疫苗和鸡传染性法氏囊病疫苗,期间未用过其他药物。根据临床和大体剖检病变观察的判断进行实验室检查，通过组织病理及血涂片观察、病原学检测，最终诊断为网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)、大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)混合感染引起肉鸡腺胃炎。

1 材料与方法

1.1 动物来源 2019年11月21日，山东威海市某养鸡场送检22日龄的AA+商品肉鸡。

1.2 主要试剂与器材 TaRaKa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒、TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒和2×TaqMaster Mix试剂，均购自宝生物工程(大连)有限公司。电泳仪(dyy-5C型，上海市六一仪器厂)；光学显微镜(Olympus 公司);石蜡切片机(rm2134型，Leica公司);生物组织包埋机(jb-L7，湖北俊杰电子有限公司);恒温水浴锅(hh-4，国华电器有限公司);电热恒温干燥箱(ws203型，江苏吴淞五金厂);PCR仪(Eppendorf公司);电子天平(fa2204A型，上海精天电子仪器有限公司);离心机(TG14 WS，湖南湘仪离心机仪器有限公司)。

1.3 大体剖检病变观察 对送检病鸡进行剖检，观察大体病变并记录。

1.4 病理组织学观察 无菌采集病鸡心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腺胃、法氏囊等组织，固定于10%的中性福尔马林溶液，石蜡包埋、切片，H.E.染色，光学显微镜下观察。

1.5 血涂片观察 无菌采集病鸡血液，制备血涂片，吉姆萨染色，光学显微镜下观察。

1.6 细菌的分离鉴定 无菌采集病鸡肝脏，接种环刮取深部组织，划线接种于血琼脂平板，37 ℃恒温箱培养18～24 h，挑取优势菌落接种于TSB肉汤培养基，37 ℃摇床培养18～24 h。

1.7 PCR扩增 根据文献[1]合成腺胃炎相关病毒如J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)、网状内皮组织增生病病毒(REV)、圆圈病毒3型(Gyrovirus 3，GyV3)、鸡贫血病毒(CAV)和马立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)的特异性引物，引物由华大基因(北京)有限公司合成，引物序列见表1。取送检病鸡肝脏，研磨，分别使用组织DNA、RNA提取试剂盒提取DNA、RNA，以DNA和RNA逆转录的cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为20 μL：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O补至20 μL。

表1 传染性病毒性腺胃炎相关病原引物序列Table 1 Transmissible viral proventriculitis related pathogen primer sequence

按细菌DNA提取试剂盒说明书提取菌液DNA，合成细菌16S rDNA常规引物，以菌液DNA为模板，进行PCR扩增。PCR产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳，送华大基因(北京)有限公司测序，并进一步分析。

2 结果

2.1 大体剖检病变 剖检可见胸肌消瘦苍白(图1A)；腹腔有泡沫样拉丝黏液(图1B)；腺胃明显膨胀肿大(图1C)；腺胃乳头消失，发生糜烂(图1D)；十二指肠有出血斑(图1E)；骨髓颜色淡呈粉红色(图1F)；脾脏萎缩(图1G)；法氏囊萎缩(图1H)。

图1 病鸡大体剖检病变(比例尺:1 cm)Fig.1 Gross autopsy of diseased chicken lesions (Scale bar: 1 cm)A：胸肌; B：腹腔; C、D：腺胃; E：十二指肠; F：股骨; G：脾脏； H：法氏囊A:Pectoralis; B:Abdominal cavity; C，D:Proventriculus; E:Dodecadactylon; F:Femur; G:Spleen; H:Bursa of Fabricius

2.2 病理组织学观察 显微镜下观察发现：腺胃间质出现炎性细胞浸润，导管上皮细胞出现增生(图2A)；腺胃黏膜的上皮细胞化生为磷状上皮细胞(图2B)；腺胃间质出现淋巴细胞浸润，腺管上皮细胞发生坏死(图2C)；十二指肠黏膜上皮细胞坏死，出现核碎裂(图2D)；十二指肠固有层出现淋巴细胞浸润，可见核分裂象(图2E)；胸腺髓质出现大量胶原纤维(图2F)。

图2 病理组织切片观察(H.E.染色)Fig.2 Observation of pathological tissue sections (H.E. staining)A：腺胃间质炎性细胞浸润(绿色箭头)，导管上皮细胞增生(黑色箭头); B：腺胃黏膜上皮细胞化生磷状上皮细胞(黑色箭头); C：腺胃淋巴细胞浸润(黑色箭头)，腺管上皮细胞坏死(绿色箭头); D：十二指肠黏膜上皮细胞坏死，核碎裂(黑色箭头); E：十二指肠固有层淋巴细胞浸润(黑色箭头)，出现核分裂象(绿色箭头); F：胸腺髓质胶原纤维增多(黑色箭头)A:Proventriculus interstitial inflammatory cell infiltration(green arrow),ductal epithelial cell proliferation(black arrow); B:Metaplasia of proventriculus mucosal epithelial cells into phosphorous epithelial cells(black arrow); C:Infiltration of lymphocytes in the proventriculus(black arrow),necrosis of glandular epithelial cells(green arrow); D:Duodenal mucosal epithelial cell necrosis,nuclear fragmentation(black arrow); E:Infiltration of lymphocytes in the lamina propria of the duodenum(black arrow),mitotic figures appear(green arrow); F:Increased thymic medulla collagen fibers(black arrow)

2.3 血涂片观察 血涂片观察发现：幼稚红细胞明显增多(图3A)；红细胞中存在大量异型性红细胞(图3B)；异嗜性粒细胞增多并且崩解释放出杆状颗粒(图3C)；外周血中出现未成熟的骨髓细胞(图3D)。

图3 病鸡的血像变化(瑞氏-吉姆萨染色)Fig.3 Blood image changes of sick chickens (Wright-Giemsa staining)A：幼稚红细胞; B：异型性红细胞(黑色箭头); C：异嗜性粒细胞(黑色箭头)； D：未成熟的骨髓细胞(黑色箭头)A:Naive red blood cells; B:Atypical red blood cells(black arrow); C:Heterophilic granulocyte(black arrow); D:Immature bone marrow cells(black arrow)

2.4 细菌分离鉴定 血琼脂培养基置于37 ℃培养箱中24 h后，长出大小均匀一致的单个菌落，菌落呈灰白色，表面光滑湿润，呈凸起的圆形(图4)。将菌液PCR扩增出现的特异性条带进行胶回收送华大基因(北京)有限公司进行测序，用DNASTAR软件对获得的基因测序结果与GenBank已发布的同源大肠杆菌序列进行比对分析，结果显示其同源性为100%。

图4 血琼脂培养基菌落形态Fig.4 Colony morphology on blood agar medium

2.5 PCR检测 将PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果显示：用CAV和REV的特异性引物进行PCR扩增，分别在676 bp和291 bp处出现阳性特异性条带(图5、图6)，将扩增的PCR产物送至华大基因(北京)有限公司进行测序，用DNA-STAR软件对获得的基因测序结果与GenBank已发布CAV和REV序列进行比对分析，结果表明其与CAV和REV的同源性均大于90%；用ALV-J、GyV3、MDV的特异性引物进行扩增，未出现阳性条带。用细菌16S rDNA引物进行菌液PCR扩增，在1 600 bp出现特异性条带(图7)。

图5 CAV基因的PCR扩增Fig.5 PCR amplification of CAV geneM：DL-1 000 DNA 相对分子质量标准; 1：阳性对照; 2：阴性对照; 3～9：肝脏M:DL-1 000 DNA marker; 1:Positive control; 2:Negative control; 3-9:Liver

图6 REV基因的PCR扩增Fig.6 PCR amplification of REV geneM：DL-1 000 DNA 相对分子质量标准； 1～5：肝脏；6：阳性对照； 7：阴性对照M:DL-1 000 DNA marker; 1-5:Liver; 6:Positive control; 7:Negative control

图7 16S rDNA菌液的PCR扩增Fig.7 PCR amplification of 16S rDNA in bacterial solutionM：DL-2 000 DNA 相对分子质量标准； 1～3：肝脏M:DL-2 000 DNA marker; 1-3:Liver

3 讨论

1978年Kouwenhoven等[2]根据荷兰发病鸡表现出生长缓慢或阻滞，高度消瘦，腺胃肿大，腺胃乳头糜烂等临床症状提出“腺胃炎”一词，我国学者王永坤等[3]1996年首次发现该病，近期本团队首次从腺胃炎肉鸡中发现腺胃炎与圆圈病毒3型(Gyrovirus 3,GyV3)有关[1]。腺胃炎临床剖检表现为腺胃高度肿胀，外观明显肿胀膨大，如“乒乓球”一样，触摸坚硬[4]，消瘦、整齐度差等[5]。鸡腺胃炎可以在不同品种的蛋鸡和肉鸡上发生，但对商业肉鸡的经济影响比较大，主要影响5～30日龄的肉鸡[6]，在世界范围内均有发生，在我国多个地区流行，由于该病的病因复杂不明[7]，死淘率高，影响生产性能的同时也产生了显著的免疫抑制，给养殖业带来严重经济损失[8-9]。

2019年11月送检病鸡根据临床症状、大体病变、组织病理学和血涂片观察以及细菌分离鉴定、病毒PCR检测综合诊断为CAV、REV和E.coli混合感染引起腺胃炎。鸡传染性腺胃炎在我国呈全国流行，近年来腺胃炎频频发生，发病率和死亡率均在50%以上[10]。该病由于致病因素复杂不明，不同的临床表现常导致混淆或复杂的诊断，当显微镜观察证实腺体发炎时，才能正确使用腺胃炎一词，并且只能通过腺胃的炎症和增大以及非化脓性坏死性腺胃炎的组织病理学证据来诊断[11]。腺胃炎组织病理学研究表明腺管上皮细胞坏死，黏膜固有层和腺体间质淋巴细胞中度或重度浸润，在腺体中随着排泄管腺管上皮细胞的增生和化生，腺体导管上皮细胞不断发生增生和化生改变，腺管上皮细胞被增生的导管上皮细胞取代[12]。而本病例从剖检腺胃肿大到病理组织学发现腺胃有炎性细胞浸润，腺管上皮细胞坏死和增生以及化生，腺胃间质淋巴细胞浸润等，在临床剖检和组织病理学方面可以确定病鸡患有腺胃炎。腺胃炎引起的主要经济问题是其影响肉鸡群整体性能，患有这种疾病的肉鸡饲料转化率增加，生长速度较慢，这意味着需要消耗更多的饲料，会造成一定的经济损失[11]。

值得注意的是多种病毒混合感染引起腺胃炎的病例越来越多，免疫抑制性病毒的感染更为严重，因为免疫抑制病与腺胃炎之间的关系比较含糊，易被忽视[13]。REV是一种常见的致肿瘤病的病毒，单独感染就可以导致肿瘤病变并极有可能表现为腺胃肿大，已被证实可与CAV协同导致更加明显的病变[14]。2种免疫抑制性病毒的协同作用加速了病情的发展，并且免疫抑制的禽类往往对疫苗没有足够的反应，容易受到二次感染。由于免疫抑制病病毒的感染，鸡群免疫能力下降，容易受到条件致病菌的继发感染，在本病例中，2种免疫抑制病的混合感染加速病情发展的同时继发感染大肠杆菌，进而导致比较严重的腺胃炎。

近年来，多种病毒混合感染比单一感染导致的免疫抑制性疾病更加严重，我国普遍存在免疫抑制病毒REV和CAV的双重感染，并且REV、CAV、ALV-J、MDV等几种免疫抑制病病毒的混合感染也越来越多。目前，REV和ALV-J没有商业化疫苗，在防控上只能通过鸡场净化来阻断病毒的传播。腺胃炎的发生在世界范围内逐渐增多，并且发病日龄的范围逐渐扩大，其病因、发病机制等尚不明确，在诊断和治疗上存在很大困难，现只能做好防控。我们认为免疫抑制病和腺胃炎的关系要联系起来，从根源上了解腺胃炎的发生，多种病毒的混合感染诱发腺胃炎的情况应该引起重视，免疫抑制病病毒和条件致病菌的早期防控对未来规模化养殖场的发展至关重要。