山东某鹅场细小病毒、圆环病毒和多瘤病毒感染情况调查

邵 震 ， 苏敬良

(中国农业大学动物医学院 农业农村部人畜共患病重点开放实验室 ， 北京 海淀 100193)

鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)、鹅圆环病毒(Goose circovirus，GoCV)和鹅多瘤病毒(Goose polyomavirus，GHPV)均是商品鹅群中常见的传染性病毒。雏鹅GPV感染自1956年发现以来在我国持续存在，因其传播迅速，死亡率高而严重威胁着商品鹅生产[1-2]。GoCV和GHPV感染早期由欧洲学者发现和确诊，近年来，我国陆续也有鹅群感染的报道。GoCV主要侵染动物的淋巴网状内皮组织，进而损伤动物机体的免疫力，使动物更易感染条件致病性病原体[3]，发病鹅生长缓慢，体重下降，尤其对肉用鹅养殖业危害巨大[4]。GHPV感染可引起死亡率极高的全身性致死性疾病，虽然我国尚未暴发过GHPV感染，但是从部分水禽源样品中也检出该病毒的存在，随着多地从国外频繁的引种，GHPV感染的可能性越来越高，一旦暴发将给我国养鹅业造成重大损失。

我国是世界上商品鹅养殖数量最多的国家，随着养殖规模的扩大和养殖方式的多样化，疾病的发生也更为频繁和复杂，在很大程度上严重威胁我国养鹅业的健康发展。目前大部分鹅病防控报道主要集中于雏鹅和产蛋鹅，对青年鹅的健康状况了解极少。在实际生产中，这3种病毒经常发生混合感染的情况，危害严重。因此，调查鹅养殖场这3种病毒的感染情况是非常必要的。本试验选择山东某鹅场作为研究对象，收集屠宰后的青年鹅脾脏1 474份，采用PCR技术对样品中GPV、GoCV和GHPV的基因片段进行检测，初步了解和掌握了该鹅场青年鹅群3种病毒的感染情况，以期为进一步开展疾病的预防和控制研究提供可借鉴的资料。

1 材料与方法

1.1 病料 山东某鹅场2019年4—11月屠宰的110～120日龄鹅的脾脏。

1.2 主要试剂 E.Z.N.A.TMViral DNA Kit，购自北京奥美德诺基因科技公司；2×TaqPCR StarMix，购自GenStar公司；Biowest，购自北京康润诚业生物科技有限公司；核酸染料，购自北京中创宏达科技有限公司。

1.3 主要仪器 离心机，Thermo Electron Corporation产品；组织匀浆机，宁波新芝生物股份科技有限公司产品；PCR仪L9600，北京莱普特科学仪器有限公司产品；电泳仪DYY-6C型，北京六一仪器公司产品；紫外投射分析仪，北京智源通技术公司产品。

1.4 试验方法

1.4.1 病料的处理 用灭菌剪刀小心将脾脏的外部去除，取内部组织装入1.5 mL冻存管中，加入灭菌的PBS和钢珠，对称放入高通量组织研磨机中磨碎(50 Hz 30 s，每次间隔10 min，运行4次)，待组织充分磨碎后，以13 000 g离心5 min，吸取上清液。

1.4.2 病毒DNA的提取 参照E.Z.N.A.TMViral DNA Kit试剂盒操作说明书进行。

1.4.3 GPV的PCR检测 本试验针对GPV基因组中编码高度保守VP1蛋白的基因序列，以发表的GPV基因组序列(GenBank登录号：EU583391.1)为参考设计1对引物：GPV-F(5′-CCTGGCTATAAGTATCTTGG-3′)，GPV-R(5′-GTAGATGTGGTTGTTGTAGC-3′)。预期扩增片段长度为593 bp。50 μL反应体系：2×TaqPCR StarMix 25 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 16 μL，待检DNA模板5 μL。反应程序：94 ℃预变性120 s；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃终末延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后观察结果，记录数据。

1.4.4 GoCV的PCR检测 本试验针对GoCV基因组中编码保守结构蛋白的基因序列，以发表的GoCV基因组序列为参考设计1对引物：GoCV-F(5′-TAAATGCGAGTTTGATGTGTCT-3′)，GoCV-R(5′-CATTTAACCCCTTCCAAAGAGT-3′)。预期扩增片段长度为564 bp。50 μL反应体系：2×TaqPCR StarMix 25 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 16 μL，待检DNA模板5 μL。反应程序：94 ℃预变性240 s；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共32个循环；72 ℃终末延伸8 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后观察结果，记录数据。

1.4.5 GHPV的PCR检测 本试验针对GHPV基因组中编码高度保守VP1蛋白的基因序列，以GHPV基因组序列(GenBank登录号：MG673522.1)为参考设计1对引物：GHPV-F(5′-CAGGCAGTGACTGTTGCAACA-3′)，GHPV-R(5′-TGTGTTTTCAT

TCCGGGATGGG-3′)。预期扩增片段长度为459 bp。50 μL反应体系：2×TaqPCR StarMix 25 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 16 μL，待检DNA模板5 μL。反应程序：94 ℃预变性120 s；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃终末延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后观察结果，记录数据。

2 结果

2.1 病料背景 该鹅场种鹅从国外引进，雏鹅为自繁自养，分别在1日龄和7日龄注射1次小鹅瘟抗体，10日龄和30日龄各免疫1次禽流感疫苗(H5+H7)，50日龄前后免疫1次鹅副黏病毒灭活疫苗。

2.2 本试验采用的PCR检测方法的验证 为了证明本试验所采用的方法及所设计的引物的确可以检测出这3种病毒的感染，本试验以前期获得的3种病毒阳性样本为检测对象，采用设计的引物按照上述反应条件可成功地检测到病毒相应的目的条带(图1)。PCR扩增产物测序结果与预期一致，证明了本试验所采取的PCR检测方法真实有效。

图1 PCR扩增GHPV(A)、GoCV(B)和GPV(C)基因片段Fig.1 PCR amplification of GHPV(A), GoCV(B) and GPV(C) gene fragmentsM：DL-2 000 plus DNA相对分子质量标准； 1：阴性对照； 2：本实验室前期获得的病毒阳性样本M:DL-2 000 plus DNA marker; 1:Negative control; 2:Positive virus samples kept in the laboratory

2.3 病料中3种病毒的检测 采用所建立的PCR方法对从山东地区鹅场收集的1 474份鹅脾脏病料进行GPV、GoCV和GHPV检测，结果显示该鹅场有不同程度的感染(表1)。检出的阳性样本总数为909份，总阳性率为61.67%(909/1 474)。单一病毒感染阳性率为38.74%(571/1 474)，其中GPV单一感染率为15.13%(223/1 474)；GoCV单一感染率为20.15%(297/1 474)；GHPV单一感染率为3.46%(51/1 474)。双重感染阳性率为16.01%(236/1 474)，其中GPV和GoCV双重感染率为7.67%(113/1 474)；GHPV和GPV双重感染率为4.68%(69/1 474)；GHPV和GoCV双重感染率为3.66%(54/1 474)。检测到GPV、GoCV和GHPV三重感染样本102份，阳性率为6.92%(102/1 474)。

表1 鹅脾脏样品中GPV、GoCV和GHPV感染情况Table 1 GPV,GoCV and GHPV infections in goose spleen samples

3 讨论

GPV、GoCV和GHPV是危害鹅养殖业的3种DNA病毒。由于GoCV和GHPV无法分离，目前除了剖检观察病变外，最常用的检测方法是PCR检测法。眼观病变受主观影响较大，且GoCV通常无明显病变，大日龄鹅感染GPV后通常无明显症状，GHPV症状较易与其他病毒混淆。综合考虑之下，PCR检测法相对快速、简单、准确。

本试验对该鹅场GPV、GoCV和GHPV感染情况进行调查，发现3种病毒的检出率较高且存在不同程度的混合感染。其中GPV检出率(34.40%)和GoCV检出率(38.40%)均显著高于GHPV检出率(18.72%)，这较为符合GHPV尚未在我国暴发的实际情况。同时对比其他学者的研究可以发现，本调查中GPV单一检出率(15.13%)低于殷奇峰[5]报道的张家口市部分地区GPV检出率(28.30%)，王传钧等[6]报道的安徽地区GPV检出率(86.11%)，龚铎[7]报道的山东地区GPV检出率(82.30%)，曹志全等[8]报道的仪征市GPV检出率(48.13%)，葛凯等[9]报道的六安市GPV检出率(33.09%)，关静[10]报道的绥滨县GPV检出率(33.86%)，武世珍[11]报道的潍坊地区GPV检出率(41.60%)和桂德旺等[12]报道的凤台县GPV检出率(34.85%)。出现这种情况的原因可能是该鹅场曾经对鹅群进行过大范围的免疫接种；而且雏鹅为自繁自养，这可能在一定程度上降低了GPV的感染率。但是从调查结果可以看出，青年鹅群仍然存在较高的GPV感染和传播风险，所以在引种时一定要把好检疫检测关，防止GPV从外输入；应该加强对青年鹅群GPV抗体水平的监测，掌握鹅群的健康状况，一旦发现问题可以及时处理。

本试验中GoCV单一检出率(20.15%)低于陈济铛等[13]报道的GoCV检出率(44.40%)，Shehata等[14]报道的匈牙利GoCV检出率(88.60%)和余旭平等[15]报道的浙江GoCV检出率(35.40%)。由于GoCV的体外分离培养存在较大困难，所以不同日龄鹅对该病毒的易感性及该病毒的致病作用尚需进一步研究和评估。

本试验中GHPV单一检出率(3.46%)低于Miksch等[16]报道的GHPV检出率(43.00%)，Palya等[17]报道的匈牙利GHPV检出率(23.17%)，Gawe等[18]报道的GHPV检出率(32.00%)，Kaszab等[19]报道的匈牙利GHPV检出率(34.56%)和Garmyn等[20]报道的比利时GHPV检出率(40.00%)，结果符合GHPV在我国尚未大范围暴发这一事实，但是同时也应该注意到正是因为我国尚未暴发过GHPV大流行，所以GHPV在我国的真实流行情况，是否存在大范围的隐性感染等一系列问题还需要进行更加深入的研究。姜甜甜等[21]曾经从鸭病料中检测出GHPV，这说明鸭源GHPV具有感染鹅群的潜在危险，鸭群可以成为GHPV的贮藏器，所以应该严防家鹅与鸭、野生水禽发生直接或间接的接触。我国水禽资源丰富，分布广泛，各地都有特色的品种，但是我国大部分水禽饲养场的养殖方式较为粗犷，养殖环境较为恶劣，饲养方式较为多样，大部分为鸭、鹅混养混饲，这无疑增加了鹅感染鸭源GHPV的风险。在鸭源GHPV流行的地区，也应加强对鹅群GHPV流行病学的调查及预防，以防造成无法挽回的损失。加强饲养管理，有计划的彻底消毒可以在一定程度上防控该病。