超高效液相色谱串联质谱检测配合饲料中三聚氰胺的方法研究

冯光宝 ，闫跃飞，高 娜，岳婷婷，潘 磊，侯玉芳，闫 磊

(1.新乡市农业农村局，河南 新乡 453000； 2.河南省种牛遗传性能测定中心，河南 郑州 450000； 3.河南省奶牛生产性能测定有限公司，河南 郑州 450000)

三聚氰胺，俗称蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，常被不良商家添加到饲料中以提高蛋白质含量。农业部第1218号公告明令禁止在饲料中人为添加三聚氰胺，并将饲料原料和饲料产品中三聚氰胺的限量值定为2.5 mg/kg。

目前检测三聚氰胺常用的检测方法有酶联免疫试剂盒检测法(ELSAE)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱检测法(GC-MS)、液相色谱法和液质联用法(HPLC-MS/MS)等[1-8]。ELISA 方法受非特异性吸附影响，易导致假阳性；HPLC方法灵敏度低，检出限偏高，易造成假阳性，适合于饲料中高含量的三聚氰胺的定量分析；GC-MS法用N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化，衍生过程中不定因素多，影响检测结果。

液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，将色谱高分离能力和质谱的高灵敏度和高选择性优点相结合[9-10]，与传统定量检测方法相比，该方法不仅可以实现定量检测，还可以实现定性检测。目前，该方法在食品、环境和饲料等许多领域得到了广泛的应用[11-13]，且由于其智能化，处理后的多个样品能够完全机械化上机进样，省时省力。目前饲料中三聚氰胺检测，农业部NY/T 1372—2007的检测标准中采用的是高效液相色谱和气质联用仪，标准中还没有专门针对饲料中三聚氰胺检测的液质方法。因此，我们在传统方法基础上，研究建立配合饲料中三聚氰胺的超高效液相色谱串联质谱检测方法，旨在为配合饲料中三聚氰胺的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1试剂耗材

对照品：三聚氰胺，纯度99.4%；甲醇、乙腈和甲酸，色谱纯；乙二胺四乙酸二钠，分析纯。固相萃取柱：Agela Cleanert PCX SPE，60 mg/3 ml。

1.1.2仪器与设备

1290 Infinity Ⅱ-6460 Triple Quad超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪,美国安捷伦;超纯水仪,Millipore synergy；电子天平,梅特勒-托利多。

1.1.3溶液配制

标准储备液：准确称取适量三聚氰胺标准品，用甲醇溶解并定容至100 ml，配制成质量浓度为1 mg/ml的标准储备液，冷冻保存。

标准中间液：吸取标准储备液1.00 ml于10 ml容量瓶内，用甲醇定容至10 ml，该溶液质量浓度为100 μg/ml，4℃冰箱内冷藏。

三氯乙酸溶液：称取10 g三氯乙酸加水定容至1 000 ml。饱和乙酸铅溶液：在50 ml水中加入一定量的乙酸铅，超声5 min，直至固体不再溶解。

氨水甲醇溶液：量取5 ml氨水于100 ml容量瓶中，用水定容至100 ml。

1.2 实验方法

1.2.1色谱条件

色谱柱为C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm); 柱温为40℃；进样体积为10 μl；流动相A为水，B为甲醇，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2质谱参数

离子源为ESI；离子化模式为正离子模式；干燥气温度为350℃；干燥气流速为11 L/min；干燥气压力为275.8 kPa；毛细管电压为4 000 V。

1.2.3提取与净化

(1)提取

称取配合饲料2 g(精确至0.001 g)于50 ml离心管中，准确加入18 ml三氯乙酸溶液和2 ml饱和乙酸铅溶液，混合均匀，超声提取20 min，0～4℃条件下，10 000 r/min离心10 min，上清液备用。

(2)净化

固相萃取小柱先用3 ml甲醇和3 ml水进行预处理。取上清液3 ml过柱，滤液以1滴/s的速度过柱，待样液完全流出后，依次用3 ml 水和3 ml甲醇淋洗，弃去全部流出液。最后用5 ml的氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液于50℃氮气吹干，用初始流动相1 ml复溶，滤膜过滤，供高效液相色-质谱联用仪测定。

(3)基质加标标准曲线的绘制

称取空白配合饲料2 g，分别精密量取三聚氰胺中间液适量，添加到空白饲料中，制得浓度范围为5～500 μg/kg的基质添加标准曲线，供超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪测定。

1.2.4检出限和定量限

称取空白配合饲料2 g(精确至0.001 g)，精密量取三聚氰胺标准溶液，添加到空白配合饲料中，制备成三聚氰胺含量分别为0.5 μg/kg和1.0 μg/kg饲料样品，按照1.2.3节的方法进行提取和净化。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

采用ESI源(电喷雾离子源)对三聚氰胺的标准溶液进行扫描，通过优化解离电压，让准离子分子[M+H]+丰度达到最大，通过优化碰撞电压，使子离子的丰度最大化，选择干扰小和丰度大的离子作为定型离子和定量离子。优化后的质谱参数见表2。

表2 质谱参数

2.2 液相色谱条件优化

化合物采用正离子模式进行扫描，以水和甲醇为流动相，进行梯度洗脱，为了获得良好的化合物峰形，对梯度洗脱条件进行优化。三聚氰胺标准溶液的总离子流图见图1。

图1 三聚氰胺总离子流图

从图1中可以看出，三聚氰胺峰尖峭，且峰形对称，无杂质干扰。

2.3 线性范围

根据上述的仪器条件，对标准溶液进行测定，以三聚氰胺的浓度为横坐标，响应面积为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线见图2。

由图2可以看出，三聚氰胺在1.0～100 ng/ml时呈现出了良好的线性关系，其相关系R2大于0.999。

图2 三聚氰胺的标准曲线

2.4 准确度及精密度实验

在空白样品中加入不同浓度的三聚氰胺标准溶液，加入量分别1、20、50和100 μg/kg，每个加标量同时做6个平行实验，按照上述的实验条件进行样品处理，通过数据处理计算方法的回收率和相对标准偏差RSD，结果见表3。

由表3可见，在4个不同加标量水平条件下，回收率85.5%～95.2%，RSD≤3.3%(n=6)，说明本方法具有较好的精密度。

表3 三聚氰胺的回收率和精密度(n=6)

2.5 检出限和定量限

该方法的检出限(LOD)通过信噪比(S/N)≥3来确定，定量限(LOQ)通过信噪比(S/N)≥10来确定。该方法的检出限为0.5 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。

3 结论

建立了超高效液相色谱联用质谱测定配合饲料中三聚氰胺的检测方法，通过优化仪器条件和前处理条件，该方法的检出限为0.5 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg，与NY/T 1372—2007标准相比，本方法的定量限更低，可以检测配合饲料中微量添加的三聚氰胺，而且本方法中采用了基质加标标准曲线，大大提高了加标回收率和准确度。结果证明该方法具有灵敏度高、特异性好、重复性高和操作简单等优点，适合测定配合饲料中的三聚氰胺。