贵州金荞麦块根中表儿茶素含量的测定及分析

向清华， 刘 辉， 简志银， 张 涛， 陶小艳， 张定红， 夏 林， 周思旋

(1. 贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳550005； 2. 贵阳金满船饲料有限公司，贵州贵阳550014；3. 贵阳市农业农村局，贵州贵阳550081)

金荞麦(Fagopyrumcymosum(Trev.)Meisn.)是蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)植物，原产于我国西南地区，其块根含有丰富的营养成分和药用成分[1]。金荞麦已被列入农业部1994年发布的《饲料药物添加剂允许使用品种目录》。“金荞麦散”是2003 年我国公布的《无公害食品肉鸡饲养兽医防疫准则》中唯一准许使用的中药制剂[2]。金荞麦具有抗菌、消炎、提高巨噬细胞吞噬能力、抗肿瘤等多种生物活性，与金荞麦中含有黄酮类化合物有关，如表儿茶素-3-没食子酸酯等[3]。表儿茶素是黄烷醇化合物类黄酮物质，具有一定的抑菌作用[4]。多年来由于各地大量采挖，野生金荞麦资源已日渐减少[5]。为保护利用好金荞麦野生资源，本项目组通过长期选育驯化，培育出国审牧草新品种“黔中金荞麦”(品种登记号：581)，现已广泛应用于贵州省生态畜牧业，并取得了一定成效。为了解贵州地区生长的金荞麦块根中表儿茶素的含量情况，本试验采集贵阳地区不同生长年限的黔中金荞麦和不同产地的野生金荞麦块根，利用高效液相色谱法(HPLC)检测表儿茶素的含量，为定向选育高含量表儿茶素的金荞麦资源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料2019 年9月，在贵州省畜牧兽医研究所麦坪试验基地(贵阳市)采集种源、栽培环境和管理条件均一致的1～3 年生黔中金荞麦块根各1份，共3份；采集贵阳市、龙里县、丹寨县、普安县、关岭自治县、罗甸县生长的野生金荞麦块根各1份，共6份。 将所有采集的样品晾晒干燥后粉碎成粗粉，放通风阴凉干燥处保存备用。

1.2 主要试剂表儿茶素(C15H14O6)标准品(购自贵州迪大生物有限公司)，色谱甲醇、色谱乙腈(购自德国默克公司)，无水乙醇(购自重庆川东化工有限公司)，蒸馏水(购自广州屈臣氏食品饮料有限公司)，聚酰胺树脂(30～60目，购自国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 主要仪器高效液相色谱仪(LC-20AD送液泵、SIL-20A 自动进样器、SPD-M20A检测器、DGU-20A3R在线脱气机、Lab-solution 色谱工作站，日本岛津公司)、C18色谱柱(规格：4.6 mm×250 mm，粒径5 μm，日本GL Sciences 公司)、电子天平(型号：A-R1140，瑞士梅特勒-托利多上海有限公司)、数显恒温水浴锅(型号：HH-6，科密仪器仪表有限公司)。

1.4 溶液的制备方法

1.4.1 标准品工作溶液的制备制备0.1 mg/mL标准品工作溶液：精确称取表儿茶素标准品1 mg，加入适量色谱甲醇溶解于10 mL容量瓶中，定容，摇匀，0.45 μm滤膜过滤备用。

1.4.2 样品溶液的制备取自然晾干、粉碎后的金荞麦块根2.00 g于烧瓶中，加入80%乙醇40 mL浸泡过夜，60 ℃加热回流2 h，过滤，取滤液于 70 ℃水浴锅上浓缩至近干，残渣加色谱甲醇溶解后转移至10 mL容量瓶中，定容，3 000 r/min离心5 min，取上清液 5 mL 过聚酰胺柱分离，用蒸馏水50 mL洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇150 mL洗脱，减压浓缩醇洗脱液，色谱甲醇溶解、转移、定容至10 mL容量瓶中，即为供试样品溶液，进样前摇匀，并用0.45 μm滤膜过滤备用。结果按干物质基础计算。

1.5 色谱条件流动相A(乙腈)，流动相B(0.4%磷酸水溶液)，流速0.7 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长280 nm。梯度洗脱：15%流动相A 0～6 min，20%流动相A 6～10 min，25%流动相A 10～12 min，30%流动相A 12～17 min，35%流动相A 17～20 min，15%流动相A 20～30 min。

1.6 线性关系考察取标准品表儿茶素工作溶液(100 μg/mL)配制成5、10、20、40、80 μg/mL不同浓度溶液，按1.5项色谱条件高效液相测定表儿茶素的峰面积，绘制标准曲线。

1.7 精密度考察精密吸取表儿茶素工作溶液10 μL，按1.5项色谱条件测定表儿茶素的峰面积，重复6次，计算其RSD值。

1.8 样品测定以1.5项方法测定各供试样品溶液，对不同生长年限的黔中金荞麦和不同产地的野生金荞麦块根表儿茶素含量进行测定，每个样品重复测定2次，记录其峰面积，取平均值作为样品中表儿茶素的含量。

2 结果与分析

2.1 线性关系以标准品表儿茶素溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程为：Y=7 803.3X-3 912.2(r2=0.999 5)。表儿茶素在5～80 μg/mL的浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

标准品 检测样品 *表儿茶素特征峰图1 高效液相测定色谱

2.2 精密度通过测定，表儿茶素峰面积的RSD值为0.10%，表明所用仪器精密度良好。

2.3 贵阳地区不同生长年限的黔中金荞麦表儿茶素含量由图1可见：表儿茶素在本实验条件下特征峰的保留时间为14.51 min。通过峰面积计算得到不同生长年限黔中金荞麦表儿茶素含量，结果见表1：贵阳地区不同生长年限的黔中金荞麦表儿茶素含量有较大差异，其中2年生黔中金荞麦表儿茶素含量最高，为349.48 μg/g；1年生和3年生含量相对较低，分别为216.15、121.94 μg/g。

表1 不同生长年限黔中金荞麦表儿茶素含量

2.4 不同产地野生金荞麦表儿茶素含量由表2可见：不同产地的野生金荞麦表儿茶素含量差异较大，其中丹寨县的野生金荞麦表儿茶素含量最高，达到590.89 μg/g。

表2 不同产地野生金荞麦表儿茶素含量

3 结论

贵阳地区生长的2年生黔中金荞麦表儿茶素含量最高，为349.48 μg/g，达到 《中华人民共和国药典》要求；丹寨县的野生金荞麦表儿茶素含量最高，为590.89 μg/g，可作为药用型金荞麦资源开发利用。

4 讨论

4.1《中华人民共和国药典》规定金荞麦药材(干物质基础)的含量测定标准采用单一的表儿茶素(C15H14O6)作为对照，其含量不得少于0.03%[6]。本试验结果表明，贵阳地区不同生长年限的黔中金荞麦表儿茶素含量差异较大，2年生黔中金荞麦表儿茶素含量最高(0.034 9%)，已达到《中华人民共和国药典》规定的要求，与张晶等[5]的研究结果相近。贵州不同产地的野生金荞麦表儿茶素含量测定结果表明，丹寨县的野生金荞麦表儿茶素含量最高，远超过贵阳、罗甸、龙里、普安、关岭地区，为下一步定向选育高含量表儿茶素的金荞麦品种资源提供了参考依据。

4.2海拔高度会导致温度、光照、水分、微生物等多种环境因子的变化，进而影响植物的生长发育、物质代谢、结构和功能，并对植物的产量、品质产生影响[7]，因此呈现出不同年限和地域的差异性。本项目组选育的黔中金荞麦分枝期粗蛋白含量较高(22.72%)，粗纤维含量低(13.51%)，必需氨基酸比例高，营养丰富，消化率高，适宜动物消化利用[8]，现已广泛应用于贵州生态畜牧业，并在推广种植和作为饲料利用方面取得了一定成效。下一步可通过在丹寨地区收集更多野生金荞麦资源并从中定向选育出表儿茶素含量高的金荞麦品种，作为药用型金荞麦资源应用于药材加工生产。