浅析PCR扩增产物中目标片段的计算方法

王梅霞

摘要PCR技术作为一项热门的技术在生命科学研究中的应用广泛，也是高考评价体系中考查载体的重要来源，但对于高中生而言该部分内容抽象难懂，就PCR产物中目标片段的计算的方法与规律进行了探讨。

关键词 PCR技术 DNA复制 目标片段计算

中图分类号G633. 91文献标志码B

《普通高中生物学课程标准（2017年版2020年修订）》提出：帮助学生达成对“基因工程赋予生物新的遗传特性”这一大概念的理解，促进学生生物学学科核心素养的提升，应开展利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。纵观历年高考试题，基因工程相关知识几乎每年必考。尤其是可以用于获取目的基因的PCR技术几乎逢考必出，且考查角度多变、难度与深度都有逐年加大的趋势。由于PCR扩增DNA的技术要求较高，一般中学很少具备实施该实验的条件，因此这部分抽象的内容对中学生而言比较深奥，甚至晦涩难懂。学生在考试中遇到PCR相关的题目时，往往会束手无策，甚至会出现弃题不做的现象。下面就PCR产物中目标片段的计算进行探讨，希望能对学生学习该部分知识有所帮助。

1例题

【例1】（2011·江苏卷）33请回答基因工程方面的有关问题：

利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（图1）。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为。

②在第轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

参考答案：①15/16②三

2解题方法

2.1常规解法——绘图法

使用绘图法解题如图2所示。

该方法虽然比较直观，但是比较耗时费力，倘若考查力度稍加深入，如“经过5个循环后两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段即目标片段的数量是多少”，利用绘图的方法解决起来就相当困难。

2.2优化解法

（1）数字组合法。

利用数字组合法解题如图3所示。

由图3可以看出，PCR过程中的模板链共有6种类型。每一轮循环只要理清每种类型的模板链的数目，即可推导出产物DNA的类型及数目。例如，第一轮循环模板链为①、②各一条，产生的DNA为：①+③；②+④（写在前面的数字代表模板链的类型，后面的数字代表产物链的类型）。则第二轮循环的模板链为①、②、③、④共4条链，产生的DNA为①+③、②+④、③+⑤、④+⑥各一个；易推出第三轮循环的模板链为①1、②1、③2、④2、⑤1、⑥1（右下角的数字代表该模板链的数目，如③2表示③模板链有2条），则产物为[①+③]1、[②+④]1、[③+⑤]2、[④+⑥]2、[⑤+⑥]1、[⑥+⑤]1（[④+⑥]2表示以④为模板合成⑥，两条链组成一个DNA分子，这种DNA分子在该循环中共2个）。那么，第三轮循环出现的⑤+⑥、⑥+⑤型DNA分子即为目标片段。还可以进一步推出第四轮的产物为：[①+③]1、[②+④]1、[③+⑤]3、[④+⑥]3、[⑤+⑥]4、[⑥+⑤]4，其中目标片段为8个。

（2）单链算法。

首先将PCR中出现的各单链用符号代替：Z代表最初的模板链；Ⅰ代表第一轮循环产生的两种子链（一端序列和目标片段不一致的单链）；Ⅱ代表目标单链。如图4所示。

那么，在扩增中，最初的模板：Z型单链2个。最终的目标为：Ⅱ-Ⅱ型DNA分子。扩增时，由Z模板得到Z-Ⅰ型DNA，由Ⅰ型模板得到Ⅰ-Ⅱ型DNA，由Ⅱ型模板得到Ⅱ-ⅡDNA。经n次循环，得到Z型单链2个，Ⅰ型单链2n个，其余为Ⅱ型单链。结合成的双链为：Z只与Ⅰ结合，余下的Ⅰ全部与Ⅱ结合（本质是双链互补形成DNA分子），得到2个Z-Ⅰ型DNA，2n-2个Ⅰ-Ⅱ型DNA，2n-[（2n-2）+2]个Ⅱ-Ⅱ型DNA，最终得到目標双链Ⅱ-Ⅱ共2n-2n个。

利用单链算法解例1，可以得出当n=1或2时，2n-2n=0，当n=3时，目标片段为23-2×3=2个，即第三轮循环才出现2个两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。

3拓展延伸

PCR技术也常常用于基因的定点诱变，通常将突变序列设计在人工合成的引物中，利用这种引物进行PCR扩增即可得到突变基因，当引物中含有突变位点时，经过几轮循环可以得到目标片段呢？经过若干循环后，目标片段的含量如何计算呢？

【例2】环状质粒PCR诱变法是一种十分简便的定点诱变技术，可用于基因工程和蛋白质工程，现以定点诱变质粒pUC18为例介绍该诱变方法。质粒pUC18上限制酶Eaml1105I的识别序列在氨苄青霉素抗性基因内部，为防止氨苄青霉素抗性基因的破坏，选择限制酶Eaml1105I的识别序列中的某碱基为诱变位点，并创设PCR体系进行扩增，所用引物和实验流程如图5所示。设定PCR的循环次数为30次，得到的初产物①主要是与质粒pUC18等长的线性DNA分子；若体系中初始质粒数为a，则终产物中含突变碱基对的DNA分子数为。

分析：（1）利用绘图方法来解决该问题比较困难，可以采用绘图和数字组合相结合的方法。首先绘出第一、第二轮的扩增产物示意图，以明确模板链的类型。如图6所示。

（2）利用单链算法解题。

最初的模板链为1、2两条。最终的目标为4+5双链DNA分子。扩增时：1→1+3、2→2+4、3→3+4 4→4+5、5→5+4。经n次循环，得单链：1，2，n个3，其余为4和5。结合成的双链，1只与3结合，2只与4结合，余下的3全部与4结合（本质是两条链互补配对形成一个DNA分子），得到：1个1+3、1个2+4、n-1个3+4，则目标片段为2n-（n-1）-1-1即2n-（n+1）。

4结束语

PCR相关的计算本质上是考核DNA分子的复制特点：半保留复制。在教学中，教师要引导学生掌握细胞内DNA复制的相关内容，注重二者之间的联系与区别。教师引导学生在平时备考中遇到相关的问题进行思维训练和方法总结，这样学生就能顺利解决PCR技术中的计算题。