外泌体在恶性胸腔积液中的作用及临床意义

张璐璐 冯小红 刘冬梅 薛庆亮

恶性胸腔积液(Malignant pleural effusion, MPE)是胸膜腔积聚大量的渗出液，并伴有恶性细胞或肿瘤组织的存在，是转移性疾病的常见并发症，可发生在15%的癌症患者中。据统计，在美国每年约有15万例新发MPE病例，欧洲每年约有10万例[1]。MPE的发病机制较复杂，除与血管生成、血管通透性升高、淋巴管阻塞有关外，免疫反应、肿瘤微环境也与MPE的形成有关。外泌体是一种具有双层脂质膜结构的囊泡，在体内分布广泛，几乎所有的细胞均可产生。其内含有的蛋白质、脂质、核酸等物质是细胞间信息交流与物质交换的重要载体。外泌体在免疫应答、血管生成、肿瘤微环境等过程中均发挥重要的调节作用。随着MPE的研究进展发现，外泌体在MPE的生成、鉴别中发挥重要作用，因此本文就外泌体在MPE中的作用进行阐述。以更好的挖掘外泌体在MPE中的作用，为MPE的诊治提供帮助。

外泌体的生物学特征及功能

一、外泌体的生物特征

外泌体是一种直径约40～160nm(平均约100nm)，由脂质双层膜包围的细胞外囊泡的一个子集，并由大多数真核细胞分泌[2]。其内含有核酸、蛋白质、脂质和代谢产物等物质，其中蛋白质包括：膜转运和融合相关蛋白、四跨膜蛋白超家族、多囊体相关蛋白及其他蛋白质[3]。脂质包括：磷脂酰胆碱、胆固醇酯、三酰甘油和心磷脂等[4]。核酸包括:长非编码RNA(Long non-codingRNA,lncRNA)、微小RNA(MicroRNA,miRNA)、环状RNA(Circular RNA,CircRNA)、mRNA、DNA等[5]。这些物质不仅反映外泌体的来源细胞，也可以作用于目标细胞产生相应的生物学功能，是健康和疾病中细胞间近距离和远距离通讯的媒介，影响细胞生物学的各个方面。

外泌体起源于内吞途径[6]。其产生过程包括质膜的双重内陷和包含腔内小泡(intraluminal vesicles，ILVs)的细胞内多囊泡体(multivesicular bodies，MVBs)的形成，以及ILV通过MVB与质膜的融合和胞吞作用，最终以外泌体的形式分泌。外泌体的形成与分泌与多种蛋白有关：包括Rab GTPases、ESCRT蛋白，以及CD9、CD81、CD63等[7]，其中RAB家族，特别是RAB27A、RAB27B、RAB11、RAB35和RAB7在调节外泌体分泌中发挥重要作用。

二、外泌体生物学功能

外泌体具有多种生物学功能，它们的作用与产生细胞的细胞类型密切相关。其中肿瘤细胞来源的外泌体(Tumor-derived exosomes，TEX)可以参与肿瘤的发生、发展、促进血管生成和肿瘤细胞的迁移、免疫反应等，因此被认为是癌症发展的多方面调节因子[8-9]。此外，TEX也是肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)的重要组成部分[10]。它们在癌细胞和TME之间充当有效的信号分子。

2 促血管生成作用 研究发现，外泌体内的非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)，特别是LncRNA和miRNA在血管生成的调控中起着重要作用[14]。此外，在胶质母细胞瘤细胞的外泌体中发现了多种促血管生成蛋白：Ang、VEGF、FGF、IL-6、IL-8和TIMP-1、TIMP-2[15]等。

3 肿瘤微环境 外泌体是TME的重要组成部分[10]。它们在癌细胞和构成TME的周围细胞之间充当有效的信号分子[16]，如：癌相关成纤维细胞源性外泌体可以通过抑制线粒体氧化磷酸化促进癌细胞生长[17]。人脂肪干细胞源性外泌体可以通过释放miR-503-3p调节肿瘤干细胞的增殖和自我更新进而来抑制肿瘤生长[18]。

外泌体与MPE的关系

一、干扰免疫反应

二、促进血管生成

外泌体富含多种促血管生成物质，其中非编码RNA在血管生成的调节中发挥重要作用。Tamiya等人收集肺腺癌及其他疾病患者的胸腔积液样本和匹配的血清样本，用聚合酶链反应分析标本中的RNA序列，发现腺癌相关性胸腔积液中外泌体分泌的miR-182和miR-210高于非肿瘤性胸腔积液[22]，而miR-210是一种促血管生成的microRNA，可通过癌症相关成纤维细胞(CAF)依赖性机制促进血管生成[23]。此外，Ang-1、Ang-2、MMP、VEGF等多种促血管生成蛋白，已被证明在MPE中发挥重要作用，同时又在外泌体内显示。随着研究的进展发现，癌细胞释放的外泌体可以改变不同类型的基质细胞，促进癌细胞生长和侵袭行为，激活内皮细胞自分泌的VEGF信号，促进肿瘤血管生成[24]。因此，外泌体可能通过直接或间接的促血管生成作用来促进MPE的形成。

三、调节肿瘤微环境

TME由细胞外基质、基质细胞和免疫细胞等组成[25]。研究表明，肿瘤细胞可以通过释放外泌体与周围微环境进行沟通，促进肿瘤的发展[15]。此外，MPE中，外泌体已被证实能够营造肿瘤转移前的微环境。Watabe等人通过对肺腺癌和肺腺癌胸膜灌洗液外泌体miRNA-21分析检测发现，肺泡灌洗液中外泌体miRNA-21可通过诱导间皮向间质转化而在胸膜腔内形成转移前微环境[26]。

外泌体在MPE诊疗中的应用前景

MPE的治疗方法虽然有很多，但大多都是姑息性治疗，主要目的是缓解患者症状，研究发现腔内用药可以提高MPE控制率，减少胸腔侵入性操作，改善患者预后，但存在一定的局限性及不良反应，且其控制情况不佳。MPE的诊断金标准是胸膜活检，但其敏感性低于胸水细胞学检查。细胞学诊断率接近60%，并且不同肿瘤类型的细胞学检查的敏感性不同，可能与胸腔积液中恶性细胞较少有关[27]。因此，目前迫切需要寻找MPE的诊疗方法。几乎所有的细胞都可以产生外泌体，包括肿瘤细胞，且外泌体内携带核酸、蛋白质等物质，可以反应其细胞来源，因此，胸腔积液中的外泌体具有成为诊断不同肿瘤源性胸腔积液的特异性生物标志物的潜能。外泌体参与MPE的发生发展，其可以作为MPE治疗的切入点，为MPE的治疗提供新思路。

一、外泌体在MPE中的诊断作用

由于外泌体在各种体液中的存在，以及miRNA在外泌体中的稳定性[28]，外泌体miRNA已成为一些癌症诊断的新的生物标志物。且一些研究已证实外泌体miRNA在MPE诊断的作用。Tamiya等人通过实验发现miR-182和miR-210在肺腺癌合并MPE中的表达水平明显高于良性胸腔积液，推测胸腔积液外泌体中的miR-182和miR-210可以作为区分肺腺癌合并MPE和良性胸腔积液新的诊断工具[22]。但Han等人通过实验发现miRNA-198在肺腺癌相关MPE中的表达显著低于良性胸腔积液，将其与肿瘤标志物癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)和细胞角蛋白19片段抗原21-1(Cytokeratin19 fragment antigen 21-1，CYFRA 21-1)相比，发现miRNA-198的诊断性能与CEA相当，而优于CYFRA 21-1，且CEA、CYFRA21-1和miRNA-198三种标志物组成的检测组合诊断效能最佳。然而，miR-198单独或全部三种标记物的诊断性能并不优于CEA和cyfra21-1联合检测[29]。因此，需进一步研究外泌体miRNA在MPE中的诊断潜能。

二、外泌体在MPE治疗中的作用

外泌体在肿瘤微环境中，由肿瘤细胞和多个间质细胞分泌。它可通过其内的多种生物分子，参与调节多种病理生理过程。研究表明外泌体可以利用其内的蛋白质、核酸等物质通过促进抗细胞凋亡途径、药物外流或药物隔离、信号转导改变、免疫细胞调节等途径来影响治疗的耐药性[30]。MPE中含有的大量外泌体在其内有多种作用，因此，MPE治疗效果不佳，可能与外泌体有关。目前已有研究证实替比法尼、奈替康唑、攀缘唑、酮康唑和三羟甲基酚为外泌体的有效的抑制剂，可以减少肿瘤患者的外泌体数量[31]。因此，是否可以利用这些药物减少或清除MPE中的外泌体，也可能是改善MPE的治疗效果的一种新的治疗方法。

外泌体作为一种天然的纳米颗粒生物载体，具有稳定、透膜、甚至可以穿透血脑屏障的特点。由于外泌体“识别”特定细胞，因此与脂质体等其他生物载体相比，外泌体给药具有更好的疗效和更少的靶向效应[12]。且与自由药物相比，外泌体的给药途径可以大大减少副作用，目前外泌体利用其天然的传递能力，已成功地作为药物和功能性RNA载体用于癌症治疗[3]。此外，通过在外泌体的外表面上显示靶向分子，例如，识别靶抗原的肽或抗体片段，可以获得靶向外泌体[32]。因此可以利用外泌体的天然载体特性及靶向功能，为MPE腔内给药提供载体，来提高腔内用药的疗效，并降低药物副作用。

研究表明，由于外泌体可以诱导肿瘤特异性免疫，其作为潜在的肿瘤疫苗引起了广泛的关注，并且已经进行了动物和临床试验来验证其疗效，如DC疫苗[24]。因此，外泌体的抗癌疫苗特性，也可能为MPE的治疗提供一条新的治疗途径。随着研究发现，外泌体与患者的生存预后也存在一点关系。通过实验发现，渗出液中与外泌体相关的miRNA表达谱与卵巢癌的预后之间存在相关性，miRNA-21高表达与患者总生存率降低有关[33]。因此外泌体可能在MPE的治疗和预后中发挥一定的作用，但需要进一步详细的研究。

展 望

外泌体具有多种生物学效应，其通过多种机制参与MPE的形成，并且外泌体具有细胞特异性，可以通过其内的蛋白质、核酸等物质来反应它的细胞来源性，因此，具有成为MPE诊断及预后的潜在生物标志物的潜能。同时，外泌体可以通过影响免疫调节、装载药物等途径参与肿瘤的治疗，而MPE是胸膜原发肿瘤和其他部位肿瘤转移至胸膜引起的胸腔积液，是恶性肿瘤的常见并发症。因此，外泌体可能为MPE的治疗提供新的途径，但还需要通过大量的实验来探索及验证。