骨碎补总黄酮在大鼠骨折愈合过程中组织病理学研究

王雪峰 薛 徽 杨 松 曹立新 张云龙 艾中伟

(1 齐齐哈尔医学院附属第一医院/骨外科 黑龙江 齐齐哈尔 161000 2 齐齐哈尔医学院附属第一医院/口腔科 黑龙江 齐齐哈尔 161000 3 齐齐哈尔医学院附属第一医院/体检科 黑龙江 齐齐哈尔 161000 4 齐齐哈尔医学院病理学院 黑龙江 齐齐哈尔 161000)

骨折是指骨完整结构被破坏，是临床常见创伤性疾病，导致其发病的因素多样，骨折治疗原则以恢复骨骼正常结构及功能，临床对于不同的骨折有着不同的治疗方案，临床常见内固定术及石膏固定法。而骨不连，骨延迟愈合是困扰临床多年的疑难问题[1-2]。随着中医学的不断发展，用于辅助临床治疗的效果显著，中医认为，骨生长发育取决于肾精胜衰，肾精不足，则髓不荣、骨生慢，故而生骨以补肾为主[3]。骨碎补是我国传统中药之一，具有补肾固元，消肿祛瘀之功效[4]。骨碎补黄酮(TFDF)是其主要有效成分，近年多位学者表示骨碎补黄酮(TFDF)可有效促进骨钙吸收，从而达到骨愈合的作用[5-6]。但对于其作用机制临床尚不明确，本研究以胫骨骨折为例，建立SD大鼠模型，以组织学病理研究为基础进行骨碎补黄酮促进骨愈合机制研究观察。

1 材料与方法

1.1实验动物

SPF级大鼠60只，雄性，10周龄，体重210～220 g，购于吉林和元生物工程股份有限公司，许可证号：SYXK(吉)2021-0005；在标准环境中饲养，并自由采食饮水。

1.2实验药品、试剂与仪器

TFDF采自北京岐黄制药有限公司(批准文号：国药试字Z20020002)；骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)试剂盒均采自上海酶研生物科技有限公司；阿尔辛蓝标准品试剂采自深圳海思安生物科技有限公司；显微CT(Micro-CT)采自GE公司 Locus SP型。

1.3实验大鼠分组、模型构建及给药

将60只大鼠进行适应性喂养1周后，随机分为药物组、对照组，每组各30只。

大鼠均采用戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，待麻醉起效后，将大鼠右下肢皮肤进行备皮处理后行骨折及内固定处理：将大鼠以仰卧位，采用聚维酮碘进行皮肤消毒，在大鼠胫骨前方做一长约2cm纵行切口，将髌韧带完全暴露，将注射器针头从内侧髌韧带远端插入点插入大鼠胫骨髓腔，穿破胫骨，用刀片造成胫骨横向骨折。骨折形成后，以注射器针头作为内固定器穿入大鼠胫骨髓腔内，将多余的针头剪掉并消毒缝合，将同侧腓骨进行保留。术毕在大鼠麻醉状态下进行X线检查，确保实验大鼠均为胫骨中断单横骨折。最后将实验大鼠送至保温箱等待自然复苏。并给予为期3d的抗炎治疗。于术后第1d开始每日给予药物组大鼠灌肠喂养TFDF 0.3ml/只，对照组大鼠给予等量生理盐水灌肠，每日对大鼠饮食、活动、毛色、排泄等一般情况进行观察。本研究所有涉及动物的操作均得到我院伦理委员会批准，并遵循国家实验室动物护理和使用指南。

1.4指标观察

分别于术后第7d、14d、21d各组随机选取10只大鼠进行断髓处死后取材。取眼球血进行血清学分析，采用酶联吸附法检测血清骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平，操作步骤均严格按试剂盒说明书进行；取胫骨标本行10%中性甲醛固定48h后取出固定针，置于检测试管内行Micro-CT检查，对骨痂整体进行观察并行定量分析，计算骨痂体积及密度；取胫骨骨折部位行石蜡组织切片制备，骨折线与切片方向垂直，切片行阿尔辛蓝染色后于光学显微镜下观察软骨骨痂及成骨组织病理变化。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 组织病理变化结果

术后7d，骨折部位愈合以纤维骨痂生成为主，三组间观察无明显差异；术后14d，软骨骨痂开始生成取代纤维骨痂，药物组软骨骨痂密度明显高于对照组；术后21d，软骨骨痂周围开始出现原始骨小梁，骨折端也逐渐有破骨细胞的生成，药物组骨小梁密度高于对照组。

2.2 血清学分析结果

两组在术后7d，OCN、ALP及VEGF水平比较无差异(P>0.05)，术后14d及21d，两组OCN、ALP及VEGF水平均有上升趋势(P<0.05)，且药物组均明显高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 血清学分析结果

2.3 骨痂体积及密度分析结果

两组在术后7d，骨痂体积、骨痂密度水平比较无差异(P>0.05)，术后14d及21d，两组骨痂体积、骨痂密度水平均有上升趋势(P<0.05)，且药物组均明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 骨痂体积及密度分析结果

3 讨论

胫骨是机体承重的重要骨骼，位于皮下，解剖位较为表浅，因而在经受暴力侵害时，常有骨折发现，为临床常见下肢创伤，以胫骨干骨折常见。临床治疗常以外科手术复位固定为主，功能康复为辅，大多数骨折患者均可恢复良好，但仍有少部分人出现骨不连，骨愈合滞后等情况，西医治疗较为困难，且易有感染发生，对患者预后不利。随着中医学的不断发展，现已成为临床常见辅助治疗，具有低成本、低风险、疗效佳的优势，得到患者及临床医师的青睐。本研究对骨碎补对骨愈合的作用进行观察。骨碎补内含丰富的黄酮，其TFDF为其主要性成分，现代药理学[7]称黄酮具有修护机体组织，促进新陈代谢，增进伤口愈合的作用。既往研究显示[8-9]，黄酮具有诱导骨活性因子分泌，改善成骨功能的作用。本研究病理组织显示，药物组恢复情况明显优于对照组，提示TFDF具有促进骨骼愈合的作用。

为了解TFDF促进骨愈合的作用机制，本研究对两组大鼠骨相关指标进行检测，结果显示药物组大鼠OCN、ALP及VEGF水平上升趋势明显优于对照组。OCN是由成骨细胞及增生的软骨细胞合成，具有调节骨骼代谢的作用[10]；骨性ALP由成骨细胞分泌，在骨转化过程中具有重要作用[11]；VEGF可刺激血管生成，在骨折愈合及骨分化过程中具有主要的血管源性调节作用，有效促进骨愈合[12]。黄酮可能通过上调OCN、ALP及VEGF水平促进骨愈合。骨痂形成是骨性连接最重要的标志，本研究显示，药物组骨痂体积及密度增长速度明显快于对照组，提示TFDF的使用可加快骨性连接的速度，进而促进骨愈合。TFDF具有促进钙磷吸收的作用，增加钙磷沉积，促进骨性因子的分泌，提高成骨细胞的增殖活性，从而加快骨痂组织的生成，促进骨愈合[13]。且药理学指出黄酮还具有抗炎、改善局部微循环的作用，可为骨愈合提供良好环境。本研究显示术后7d两组恢复情况无明显差异，可能与TFDF药效反应时间有关。且于病理学组织分析可见14d后开始有软骨骨痂生成，药物组生成情况优于对照组，21d后差距增大，提示临床使用可延长其服药周期，以保证临床疗效。关于毒副反应，本研究30只大鼠在用药期间均无明显不良反应发生，提示其安全性较好。

综上所述，TFDF可能通过上调OCN、ALP及VEGF水平，促进软骨骨痂生成且加快其向骨性骨痂转变的进程，提高骨痂密度促进骨愈合；术后14d出现软骨生成，21d开始进行骨折重建修复。