不同秋眠级苜蓿越冬前后叶片光合作用的比较研究

张浩阳， 刘美君*，卫丹丹，苗 宇，张丽佳

(1. 新疆农业大学草业学院，新疆草地资源与生态实验室，新疆 乌鲁木齐 8320052；2. 忻州师范学院，山西 忻州 034000)

紫花苜蓿以其环境适应能力强、草质优、产量高和水土保持能力强等优点，被冠以“牧草之王”的美称[1-3]，在新疆广泛种植。由于新疆特殊的地理气候条件，冬季低温、春冻寒潮等极端天气时有发生，影响苜蓿的顺利返青，严重制约新疆苜蓿产业的发展。因此，筛选抗寒性好、返青率较高的苜蓿品种，研究其抗寒性机制，能够为提高苜蓿越冬、返青率的研究提供理论支持，对于新疆的苜蓿产业发展有重要的意义[4-8]。

秋眠性是与日照变化有关的一种秋季生长特性，是对短日照的一种生长反应，大量的研究表明，秋眠等级与越冬率之间存在着极显著负相关的关系，目前，秋眠级是评价苜蓿越冬能力的重要指标之一[9]。同时，秋眠性是苜蓿对晚秋生长环境变化的一种适应性反应，也是实现越冬、返青等过程的关键基础[10]。董静华等[11]研究表明苜蓿的秋眠级别与越冬性呈显著负相关；Brouweretal等指出植株的高度与冻害、冷害呈正相关[12]。然而不同秋眠级的苜蓿在相同环境下到达各个生育期时间不同，秋眠级越低的品种，其进入各个生育期时间也会越晚，反之则会提前[13]。王晓龙[14]等研究结论说明，秋眠级低的苜蓿品种越冬能力相对更强，可以更好适应寒冷的环境。卢欣石[15]对国内23个审定苜蓿品种及92个地方品种的秋眠级别进行了测定，发现苜蓿秋眠级别与其耐寒能力有直接关系，秋眠性强，抗寒能力较强。但是苜蓿秋眠级影响其抗寒性的作用机理至今尚不明确。

光合作用是植株生产力的重要过程，也是限制作物产量的关键因素[16]。同时光合作用的日变化是植物生产过程中物质积累、生理代谢以及能量转化的基本单元[17]。低温会直接损害植物的光合器官，降低其光能同化率，对植物造成严重伤害[18]。随着低温胁迫时间的延长，植物净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)等光合参数会持续下降，但当低温胁迫解除，光合参数都会有明显回升[19]。王瑞霞[20]等研究表明，低温胁迫下，小麦的光合速率、蒸腾速率以及气孔导度都会出现显著下降；烟草叶片在低温胁迫后，出现净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)与气孔导度(Gs)下降，导致同化物积累量下降；同时气孔收缩度增大，抑制气体交换，导致胞间CO2浓度(Ci)降低，造成光合产物合成原料不足[21]。并且在低温胁迫下会影响到叶片光能的吸收、转换与光合电子传递，致使过剩的激发能大量积累于PSⅡ反应中心，进而损伤植物叶片的PSⅡ反应中心，导致光合作用能力减弱。此外，前人研究发现荧光参数可以反映苜蓿抗寒性的强弱[22]，因此，通过研究光系统Ⅱ的活性可以反映叶片光合器官的活性。其中叶片的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)，PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)均随着低温胁迫时间延长出现显著下降[23-27]。但是相关研究中关于越冬过程中不同秋眠级苜蓿光合活性的差异研究内容较少。

因此，本研究从紫花苜蓿叶片光合活性角度出发，通过对2种不同秋眠级的紫花苜蓿越冬前后的光系统活性、光合速率以及气孔结构的测定，研究了不同秋眠级紫花苜蓿越冬前后叶片光合活性的变化差异，阐明苜蓿秋眠级影响其抗寒性的作用机理，以期为苜蓿抗寒品种的选育和高产栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地设在新疆农业大学三坪实践教学基地，位于欧亚大陆腹地，天山山脉北坡，属新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市；大陆性干旱、半干旱性气候；海拔850 m；年均温度6.5℃，年极端最高温度38.8℃，年极端最低温度-41.5℃；冬季有积雪，年降水量230 mm，年蒸发量2570 mm；土壤冻结期11月中旬，解冻期3月中旬，无霜期150 d左右，共设置20个小区，每个小区长4 m，宽3 m，播种行距30 cm，每小区播10行。2017年5月播种，人工开沟条播，播深2 cm，播种量1.5 kg·亩-1。采取常规的田间管理措施，人工除草。

1.2 供试品种

供试紫花苜蓿品种为准格尔和劲能806。准格尔是一种优良紫花苜蓿品种，其秋眠级为1级，劲能806秋眠级为8级[28]，由于新疆冬季积雪较厚，对苜蓿根茎有保温作用[29]，通过前期实验可以确定两个品种都可以实现安全越冬。

1.3 测定指标和方法

1.3.1基本光合参数测定 于2018，2019和2020年10月，采用Ciras-2便携式光合仪，选择晴朗无云天气，选取小区内长势均匀的植株，从9:30到20:00，监测不同秋眠级紫花苜蓿的倒数第3片完全展开叶，测定指标为叶片的光合速率(Pn)。用于研究不同秋眠级紫花苜蓿光合作用的日变化。

分别于越冬前2018，2019和2020年10月下旬和越冬后5月上旬，采用Ciras-2便携式光合仪，选择晴朗无云天气，分别在10:00，13:00，16:00，在各时间点测定重复3天，选取小区内长势均匀的植株，监测紫花苜蓿的倒数第3片完全展开叶，测定指标为叶片的光合速率(Pn)、蒸腾速率(E)、气孔导度(Gs)以及胞间CO2浓度(Ci)，用于分析越冬前后不同秋眠级紫花苜蓿光合速率的差异。

1.3.2叶绿素荧光参数测定 于 2018，2019和2020年5月，采用Handy PEA进行测定，选择晴朗无云天气，选取小区内长势均匀的植株，从9:30到20:00，测定相同叶位叶片(植株顶端第一个完全展开三叶的中间小叶)。测定前，用叶夹暗适应叶片20 min，每2 h测定1次。每个品种重复10次。用于分析不同秋眠级紫花苜蓿光系统Ⅱ活性日变化特征，主要测定指标为最大光化学效率(Fv/Fm),叶片光合性能指数(PIabs)。

于2018，2019和2020年10月下旬和越冬后5月上旬，选择晴朗无云天气，选取小区内长势均匀的植株，使用Handy PEA进行测定，分别在10:00，13:00，16:00，测定相同叶位叶片(植株顶端第一个完全展开三叶的中间小叶)。测定前，用叶夹暗适应叶片20 min。每个品种重复10次，每个时期测定3 d。用于分析越冬前后紫花苜蓿叶片光系统Ⅱ活性的差异，主要测定指标为最大光化学效率(Fv/Fm),叶片光合性能指数(PIabs)。

1.3.3气孔结构观察及参数测定 于2018，2019和2020年10月下旬和3月下旬越冬中、越冬后5月上旬，分别采样，使用NIkon SMZ1000显微镜分别观察两品种处理前和恢复后的气孔结构变化及气孔长度、宽度、气孔孔径宽度及长度的指标变化。

1.4 数据分析

根据上述测定方法，除了特定时间点测量的光合参数是以重复3 d进行测定以外，其余每年每个品种测定10次重复。由于光合日变化3年变化趋势相似，本文选取较为典型其中一年的相关数据进行分析。其余所使用数据采用3年平均值，使用Excel软件和SPSS17.0统计软件进行数据处理和方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同秋眠级苜蓿光合速率日变化特征

不同秋眠级苜蓿叶片光合速率(Pn)的日变化整体趋势相近，呈现三锋曲线，如图1所示。清晨苜蓿叶片的光合速率开始缓步上升，劲能806和准格尔的Pn值于10：00达到第一个高峰，峰值分别为2.6和4.0 μmol·m-2·s-1；劲能806和准格尔的Pn的第二个峰值分别出现在13：00和14：00，峰值分别为10.9和8.6 μmol·m-2·s-1；劲能806和准格尔的Pn的第三个峰值分别出现在16：00和18：00，峰值分别为11.6和12.2 μmol·m-2·s-1。这表明，上午随着光照强度增强，苜蓿的光合速率随之增加；午间出现光合速率的下降，可能是由于光合“午休”的出现或是发生强光光抑制；而随着时间推移，光照强度下降，光合速率回升，直到18：00光照强度下降，光合速率也随之降低。

图1 不同秋眠级紫花苜蓿光合速率日变化特征

2.2 不同秋眠级紫花苜蓿光系统Ⅱ活性日变化特征

叶片光系统Ⅱ的最大光化学效率(Fv/Fm)反映了苜蓿叶片光系统Ⅱ的活性。如图2A所示，不同秋眠级苜蓿的Fv/Fm整体变化趋势相同，在9：00点时，劲能806和准格尔的Fv/Fm值分别为0.73和0.65，随后劲能806开始缓慢下降，而准格尔的Fv/Fm先上升后下降。劲能806和准格尔的Fv/Fm分别于10：30和15：00以后开始趋于稳定，劲能806和准格尔的Fv/Fm分别在10：00(15：00)和12：00达到最小值；劲能806和准格尔当日Fv/Fm最小值分别为0.66和0.59，于15：00以后两品种都开始上升，到晚上21：00之前一直在不断上升。而劲能806苜蓿和准格尔苜蓿的Fv/Fm最高值都在晚上21：00出现，分别是0.85和0.84；劲能806苜蓿的最低值是在10：00，15：00，都为0.66，而准格尔苜蓿是12：00，为0.59，所以通过对比可以看出准格尔苜蓿Fv/Fm变化幅度较大。

图2 两品种Fv/Fm日变化特征(A)、PIabs日变化特征(B)和Fv/Fm与PIabs落差幅度(C)

不同秋眠级紫花苜蓿的叶片光合性能指数(PIabs)整体变化趋势相近。清晨两品种的PIabs变化平稳，而劲能806苜蓿从9：00后开始下降，12：00时降到最低点，而准格尔苜蓿从10：00后下降到最低点。准格尔和劲能806的PIabs分别在12：00，15：00以后开始出现快速上升，这时由于光照强度开始降低，光抑制程度逐渐减弱。劲能806和准格尔的PIabs值分别于15：00和12：00到达谷底，最小值分别为0.22和0；相比劲能806，准格尔的PIabs值上升得慢，劲能806在午后的上升速率明显大于清晨下降速率；两个品种苜蓿到21：00仍持续上升，劲能806上升速率下降，而准格尔上升态势不变，且劲能806和准格尔的PIabs值达到测定时间内的最大值，分别是4.3和2.8，明显大于清晨叶片的PIabs值。根据两个品种的叶片单日Fv/Fm和PIabs值相比较的结果可以看出，准格尔和劲能806的PIabs值相对Fv/Fm值变化更加敏感。

2.3 越冬前后不同秋眠级紫花苜蓿光合速率Pn，E，Gs，Ci的对比

依据以上不同秋眠级紫花苜蓿叶片光合速率(Pn)的日变化规律，在越冬前后分别选10：00，13：00和16：00三个典型时间点代表上午、中午和下午对苜蓿光合速率相关指标进行测定，研究越冬前后不同秋眠级苜蓿光合活性的差异。如图3A所示，图中的劲能806与准格尔苜蓿相比，在越冬前准格尔苜蓿的光合速率较低，结果表明，苜蓿品种的秋眠级越低，光合速率越低，生长越慢。与越冬前相比，在越冬后劲能806和准格尔叶片的Pn值更高，且准格尔较劲能806光合速率更高。这表明，越冬后气温等环境条件的不断恢复，苜蓿恢复生长，并且秋眠级较低的准格尔相较于劲能806的光合能力和光合速率恢复较快。

两品种苜蓿越冬前后的蒸腾速率(E)、气孔导度(Gs)以及胞间CO2浓度(Ci)也呈现很大差异。

如图3B所示，蒸腾速率(E)，越冬前苜蓿叶片的蒸腾速率先增加，13：00时达到最大值，16：00时下降，且准格尔叶片蒸腾速率变化幅度比劲能806变化幅度更大。这表明准格尔叶片对环境变化更为敏感；越冬后两品种的苜蓿叶片的蒸腾速率在一天内逐渐增加。越冬前后，准格尔叶片蒸腾速率明显都低于劲能806。

从图3C中的Gs(气孔导度)值可以看出上午两个不同品种苜蓿叶片越冬前的气孔导度都明显高于越冬后，除劲能806在13：00出现相反情况；同时在下午16：00两个品种苜蓿叶片越冬前的气孔导度略大于越冬后，但差异不显著；中午准格尔叶片气孔导度在越冬前和越冬后无显著差异，而劲能806越冬前显著小于越冬后。

如图3D所示，越冬前，两个不同品种的苜蓿的胞间CO2浓度呈U型日变化，即上午下午较高而中午下降。且两个品种苜蓿叶片Ci在同一时间无显著差异。越冬后，准格尔苜蓿叶片在三个时间段内Ci差异较小，而劲能806叶片Ci在中午达到最大值。同时两个品种的苜蓿的越冬前Ci值明显高于越冬后的值。

图3 不同秋眠级紫花苜蓿越冬前后光合速率(Pn)、蒸腾速率(E)气孔导度(Gs)以及胞间CO2浓度(Ci)的对比

2.4 越冬前后不同秋眠级紫花苜蓿光系统Ⅱ活性的对比

根据不同秋眠级紫花苜蓿叶片光系统 Ⅱ 的最大光化学效率(Fv/Fm)和叶片光合性能指数(PIabs)的日变化规律，在越冬前后分别选择10：00，13：00和16：00这3个典型时间点对苜蓿进行测定，对比越冬前后不同秋眠级紫花苜蓿光合活性的差异。图4A和图4B是越冬前后劲能806苜蓿和准格尔苜蓿的Fv/Fm和PIabs对比图。与越冬前相比，越冬后劲能806的Fv/Fm和PIabs显著升高。在越冬前，劲能806的Fv/Fm和PIabs较准格尔的Fv/Fm和PIabs要偏高；但在越冬后，劲能806的Fv/Fm和PIabs较准格尔的Fv/Fm和PIabs偏低。这表明，准格尔苜蓿叶片光合活性有较强的低温抗性；同时在越冬后，准格尔光合活性的恢复能力比劲能806更强。

图4 劲能806、准格尔苜蓿越冬前后光合活性的对比

2.5 越冬前后不同秋眠级紫花苜蓿气孔结构的对比

通过对比可以发现，处理前两品种的苜蓿整个气孔形态饱满，轮廓较为清晰；但经过低温处理后，气孔整个形态发生较大变化，保卫细胞发生变形，气孔变窄、缩短，出现畸形气孔，限制了CO2进入叶肉细胞，从而对光合作用产生较大影响；而恢复后两品种的苜蓿叶片的气孔形态发生恢复，保卫细胞恢复正常形态，气孔功能逐步恢复正常(图5)。

图5 不同秋眠级紫花苜蓿模拟越冬前后气孔结构变化的对比

通过图6中处理前后及恢复后气孔各项数值对比可以看出，其整体呈现U型走势变化，且两品种紫花苜蓿不论是气孔宽度、长度以及孔径宽度、长度都在越冬过程中出现了明显的下降趋势，而越冬后则存在明显的恢复，准格尔苜蓿较劲能806气孔各项数值整体恢复较快，说明其对低温的抗性高于劲能806。并且与图5中相比较可以发现，在越冬中的低温环境会导致气孔结构的发生明显的变化，引起气孔长度、宽度及其孔径开度、宽度的下降，从而导致气孔导度的下降，进一步影响苜蓿叶片内CO2浓度，最终使得苜蓿的光合能力受到影响。

图6 不同秋眠级紫花苜蓿模拟越冬前后气孔长度(A)、宽度(B)及孔径长度(C)和宽度(D)的对比

3 讨论

Fv/Fm和PIabs反映了光系统Ⅱ的活性。许多研究已证明光系统Ⅱ是光抑制发生的重要部位，不同的胁迫如强光、干旱、冷害和热害等都会导致PIabs值下降，从而使植物更易受到光抑制的伤害[30]。本研究发现，不同秋眠级的苜蓿的Fv/Fm和PIabs的变化规律是呈现U型变化趋势，清晨两品种的PIabs变化平稳；劲能806和准格尔的PIabs值分别于15：0和12：00到达最低；直到20：00恢复。这表明，在正常田间管理条件下，中午由于强光照射，紫花苜蓿叶片也不可避免的发生光抑制，导致PSⅡ活性的下降，由于苜蓿叶片自身的光破坏防御作用[31]，使得叶片PSⅡ的活性在晚上没有强光照射时会自行恢复。

植物的PIabs是光合性能指数，反映植物光系统Ⅱ的活性。Fv/Fm为开放的PSⅡ反应中心捕获激发能的效率，Fv/Fm的变化代表PSⅡ光化学效率的变化，以吸收光能为基础的性能指数PIabs可以更准确地反映植物光合作用的状态，是光抑制程度的一个重要指标，其比值越高表明光抑制的程度越低，是研究植物胁迫的重要参数[32]。本文中越冬前准格尔的叶片单日PIabs值的极差值为2.8，单日波动幅度较大。越冬前准格尔的叶片单日Fv/Fm值的极差值较小，单日的波动浮动较小。这表明在本研究中PIabs相较于Fv/Fm对于苜蓿叶片所处的环境变化更为敏感，与前人研究结果相似[33]。

光合日变化随植物种类和环境条件的不同而变化，是分析环境因素影响植物生长和新陈代谢的重要手段之一。本文中苜蓿的叶片净光合速率呈现三峰曲线，这与韩清芳[34]等的试验结果一致。三个峰值分别出现在10:00，13:30和16:30左右。李超[35]等发现了苜蓿日净光合速率变化的两个峰值分别为10:00和14:00。两品种紫花苜蓿在13:00—16:30之间Pn出现显著降低，可能与“午休”现象有关。本实验中出现光合“午休”是植物对于炎热自然条件的生态适应和自我调节机制的表现。不同条件下引起光合作用午间降低的因素也不同。研究结果表明，早晨光照强气温低，净光合速率也很低，但随着光合有效辐射的增大，气温显著升高，气孔开放程度增加，苜蓿叶片净光合速率明显提高；中午高温导致净光合速率下降，下午随着环境中温度、光照强度不断下降，光合能力处在不断恢复过程中，从而使下午的峰值低于上午的峰值。同时本研究指出，两个品种越冬前Ci都显著高于越冬后，但越冬后苜蓿叶片光合速率显著高于越冬前，这表明，越冬前后光合速率受到不同的因素影响，其中气孔因素是由于中午田间光照、温度和湿度等环境因子的变化引起植物气孔的部分关闭，CO2进入叶片受阻而使光合下降；而非气孔因素是由于叶肉细胞自身羧化酶活性的下降而引起Pn的降低[36]。越冬前，光合速率较低，但气孔导度和胞间CO2浓度较高，气孔孔径也没有出现明显变化，气孔结构也未有较大改变，以上说明，越冬前苜蓿叶片光合主要受叶肉羧化效率的影响，即非气孔限制。越冬后，随着光强的增强，苜蓿叶片光合速率逐渐增加，但是，气孔导度和胞间CO2浓度增加程度较低，同时气孔孔径出现了明显的皱缩变窄，气孔形态也发生了改变，这表明越冬后可能是由于低温导致苜蓿叶片光合速率下降，也可能是返青期叶片发育的原因导致气孔开度不足，从而使光合作用受到气孔限制。

苜蓿的秋眠性是其对秋季环境变化的一种适应性反应[34]，与品种产量和适应性之间的具有密切关系。不同秋眠级的两品种紫花苜蓿在越冬前和越冬后的光合作用有显著差异。越冬前秋眠级较高的劲能806光合速率较大，生长更快。越冬后两品种间差异较小，但秋眠级较低的准格尔因为气孔恢复较快，光合恢复也更快，所以其光合速率较高。说明秋眠级较低的准格尔拥有较好的抗低温的能力。

4 结论

光合速率日变化趋势呈三峰曲线，而苜蓿叶片光系统Ⅱ活性的日变化趋势呈U型曲线。不同秋眠级苜蓿越冬前后光合作用差异显著，其中秋眠级较高的苜蓿叶片光合速率比较高。越冬前苜蓿叶片光合作用主要受到非气孔限制，越冬前秋眠级较高的苜蓿光合活性较高，生长较快。而越冬后则是由于气孔结构受到低温以及气孔自身发育的影响，光合作用受到气孔限制。秋眠级低的苜蓿气孔结构恢复较快，光合作用恢复更快，有较强的抗低温性。